鯉天然免疫識(shí)別受體 TLR1和TLR21的基因克隆及免疫功能的初步研究.pdf

1、Toll樣受體（TLRs）是重要的模式識(shí)別分子，是連接適應(yīng)性免疫和天然免疫的橋梁。TLRs受體可以分為六大亞家族，TLR1家族、TLR3家族、TLR4家族、TLR5家族、TLR7家族、TLR11家族。魚類是目前已知的TLRs種類最多的物種，目前已經(jīng)在魚類中發(fā)現(xiàn)21種TLRs。對(duì)魚類TLRs的研究可以為天然免疫的進(jìn)化研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　本研究運(yùn)用PCR技術(shù)和RACE技術(shù)首次從鯉中克隆得到TLR1和TLR21基因的全長(zhǎng)。TLR1的

2、cDNA全長(zhǎng)為2626 bp，開放閱讀框（ORF）為2166 bp，編碼721個(gè)氨基酸殘基， TLR21的cDNA全長(zhǎng)為3604 bp，ORF包含2892 bp，編碼963個(gè)氨基酸殘基，利用SMART軟件對(duì)兩者的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的TLRs受體結(jié)構(gòu)，包含了一個(gè)胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜區(qū)、一個(gè)胞外亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域。使用BioEdit軟件對(duì)不同物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)胞外具有天冬酰胺位點(diǎn)，推測(cè)與馬蹄狀結(jié)構(gòu)形成有關(guān)，

3、胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域保守性較高。利用I-TASSER軟件在線模擬TLR1和TLR21的三維空間結(jié)構(gòu)，證實(shí)了兩者典型的TLRs受體家族特征。使用MEGA6軟件對(duì)不同魚類及部分哺乳動(dòng)物構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)鯉魚的TLR1屬于TLR1家族成員，與草魚的親緣關(guān)系最近，而TLR21屬于TLR11家族成員，與斑馬魚和大西洋鮭魚的親緣關(guān)系最近。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鯉TLR1和TLR21在肝臟、脾臟、頭腎、前腸、后腸、鰓、性腺、皮膚、肌肉、口腔上皮和腦

4、等11種組織中表達(dá)分布情況。結(jié)果顯示，TLR1在腦、脾臟、頭腎和性腺中表達(dá)較高，在后腸和口腔上皮細(xì)胞中表達(dá)較低，TLR21在脾臟和頭腎中表達(dá)較高，在皮膚和肝臟中表達(dá)較低。對(duì)鯉進(jìn)行嗜水氣單胞菌注射刺激后，TLR1 mRNA的表達(dá)量在前腸、后腸和肝臟中有明顯升高的趨勢(shì)，其中在后腸和肝臟中升高為對(duì)照組的7倍，TLR21 mRNA的表達(dá)量在肝臟、前腸和后腸中有升高的趨勢(shì)。對(duì)鯉進(jìn)行腹腔注射poly(I:C)，誘導(dǎo)了其肝臟、脾臟、頭腎、前腸和后腸中