煙草γ-tubulin基因沉默的效應(yīng)分析.pdf

1、γ-微管蛋白基因是自然界最保守的基因之一,其編碼蛋白是微管組織中心(microtubulin organization center,MTOC)的重要組成成分。人們最早在動(dòng)物上的研究表明,γ-微管蛋白作為動(dòng)物中心體的一種重要成分,在微管的成核、細(xì)胞周期調(diào)控以及有絲分裂紡錘體的形成等方面起非常重要的作用。由于植物細(xì)胞中沒(méi)有中心體的結(jié)構(gòu),它在植物細(xì)胞中的功能一直沒(méi)有非常明確的答案,這也成為近年來(lái)很多植物細(xì)胞生物學(xué)家關(guān)心的熱點(diǎn)問(wèn)題。

2、鑒于γ-tubulin基因是一種非常重要的保守基因,它的斷裂可引起生物致死,因此應(yīng)用傳統(tǒng)方法研究其功能很困難。最近國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用負(fù)向遺傳學(xué)的手段進(jìn)行了大量的研究,Pavia和Martine分別利用誘導(dǎo)型的RNA干涉的方法及通過(guò)篩選得到γ-tubulin基因的突變體的方法研究了該基因?qū)M南芥植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響,發(fā)現(xiàn)γ-tubulin低表達(dá)可影響到葉片的生長(zhǎng)、根的發(fā)育及氣孔的排布等。本研究組也利用PVX誘導(dǎo)的γ-tubulin基因沉默的方法

3、,首次得到了γ-tubulin基因低表達(dá)的煙草植株,發(fā)現(xiàn)該基因的低表達(dá)對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的影響,如葉片形狀變窄、長(zhǎng)寬比明顯增大、葉片部分區(qū)域出現(xiàn)明顯的皺褶或卷曲,在生殖生長(zhǎng)階段甚至出現(xiàn)全部花苞脫落等特殊表型。 本研究首先以煙草(N.tobacum var.Samsun NN)無(wú)菌苗為材料,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù),將攜帶有部分正反串連的γ-tubulin基因片段的載體轉(zhuǎn)化到煙草無(wú)菌苗中,利用得到的γ-tubulin基因低表

4、達(dá)的煙草轉(zhuǎn)化體的表型來(lái)進(jìn)一步分析該基因?qū)χ参锷L(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果表明,γ-tubulin低表達(dá)對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了明顯的影響：有80％左右的植株出現(xiàn)了多個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)；而且葉片形態(tài)出現(xiàn)異常,有大量的聯(lián)體葉或筒狀葉出現(xiàn)；另外植株根的形態(tài)也發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為主根不發(fā)達(dá)而側(cè)根呈強(qiáng)勢(shì)生長(zhǎng)的“魚(yú)刺狀”。對(duì)植株生長(zhǎng)素IAA的分析測(cè)定發(fā)現(xiàn),γ-tubulin低表達(dá)植株其內(nèi)源生長(zhǎng)素IAA含量明顯高于對(duì)照空載植株,通過(guò)進(jìn)一步對(duì)其極性運(yùn)輸輸出載體基因P-gl

5、ycoproteins(PGP1)的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),PGP1在γ-tubulin低表達(dá)植株上部的表達(dá)量明顯低于對(duì)照空載植株。因此推測(cè),γ-tubulin低表達(dá)對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響可能與生長(zhǎng)素合成異常及其極性運(yùn)輸受到抑制有關(guān),從而最終使植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生異常。 另外,本研究還分析了含有γ-tubulin部分插入片段(從319核苷酸至841核苷酸的522 bp的編碼區(qū)片段)的重組PVX載體(PVX:as_Gam_D)侵染的煙草植株的花藥

6、發(fā)育情況。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)植株花苞發(fā)育到一定時(shí)期時(shí),出現(xiàn)所有花苞陸續(xù)脫落的現(xiàn)象。利用Real time PCR檢測(cè)花苞基部γ-tubulin的表達(dá),發(fā)現(xiàn)被PVX:as Gam D侵染的煙草中γ-tubulin mRNA水平明顯降低,這表明在這些植株中發(fā)生了γ-tubulin的基因沉默。應(yīng)用石蠟切片法分別對(duì)對(duì)照植株(PVX空載體侵染的植株)花苞和γ-tubulin基因沉默的植株花苞進(jìn)行觀察,結(jié)果表明：野生型煙草中小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育過(guò)程正

7、常,有雄蕊5枚,雄蕊原基經(jīng)過(guò)一系列分化后發(fā)育形成4個(gè)小孢子囊,造孢細(xì)胞進(jìn)一步分化形成排列緊密的小孢子母細(xì)胞,小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂最終形成四分體；經(jīng)正對(duì)照PVX空載體侵染的煙草,其小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育過(guò)程無(wú)異常；γ-tubulin基因沉默的煙草小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育出現(xiàn)明顯的異?，F(xiàn)象：有的花苞在造孢細(xì)胞時(shí)期發(fā)育正常,隨著小孢子進(jìn)一步發(fā)育到小孢子母細(xì)胞時(shí)期時(shí)出現(xiàn)了異常,發(fā)生早脫；有的花苞在四分體時(shí)期絨氈層細(xì)胞和小孢子發(fā)生了畸變導(dǎo)致脫