柑橘黃龍病可視化LAMP檢測體系的建立及其室內(nèi)防治藥劑篩選.pdf

1、柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是由韌皮部桿菌屬（Candidatus liberibacter）侵染引起的一種毀滅性病害，是國內(nèi)外植物檢疫對象之一。該病主要分布在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50個國家和地區(qū)，中國19個柑橘生產(chǎn)?。ㄊ?、自治區(qū)）中已有11個受到HLB的危害，對世界柑橘產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅。由于目前尚無有效防治藥劑和抗病品種，主要采取加強(qiáng)檢疫、挖除病樹、防治木虱和種植無病

2、苗木等防控措施，因此加強(qiáng)柑橘黃龍病的早期診斷和防治藥劑篩選，對于防止黃龍病疫情擴(kuò)散及有效防控尤為重要。
　　鑒于國內(nèi)學(xué)者建立的柑橘黃龍病LAMP檢測體系，在結(jié)果上或無法實(shí)現(xiàn)可視化，或采用的可視化方法（開蓋加顯色指示劑）容易造成污染的問題，本研究利用鈣黃綠素（Calcein）的熒光顯色指示劑作用，建立了可視化的柑橘黃龍病LAMP檢測體系，因Calcein在LAMP反應(yīng)開始前加入，所以避免了因開蓋操作而造成反應(yīng)產(chǎn)物污染。在該方法中，以

3、柑橘黃龍病菌16S rDNA靶序列的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物（2條內(nèi)引物、2條外引物)，通過調(diào)整反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、Mg2+、dNTP、甜菜堿和引物的濃度，優(yōu)化了LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，并對其特異性和靈敏度進(jìn)行驗證。研究確定最佳反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時間70 min。特異性檢測結(jié)果顯示：柑橘黃龍病菌總DNA樣品LAMP產(chǎn)物均為陽性(綠色)，而其它9個供試樣品LAMP產(chǎn)物均為陰性(橘黃色)；靈敏度驗證結(jié)果顯示：該檢測體系對感染黃龍病

4、菌的柑橘葉片總 DNA的檢出限為1.51×10-3 ng/μL，而對陽性質(zhì)粒DNA的檢出限為2.12×10-6 ng/μL，與實(shí)時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR， qPCR）靈敏度相當(dāng)，而比常規(guī)PCR靈敏度高1000倍。對田間采集的柑橘黃龍病疑似癥狀樣品分別采用LAMP和qPCR體系進(jìn)行檢測，并比較2種檢測方法的樣品檢出率和2種檢測方法間的檢測符合率，以驗證可視化LAMP技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用效果。結(jié)果顯示

5、，從福建漳州、南平、福州等地區(qū)采集的30份具有柑橘黃龍病疑似癥狀的蘆柑葉片，可視化LAMP檢測技術(shù)和qPCR檢測技術(shù)的檢出率均為76.7％（23/30），2種檢測方法間的檢測符合率為100%，表明可視化LAMP檢測方法快速、簡便、特異、靈敏，適合于基層部門和田間使用，為柑橘黃龍病早期診斷提供了一種新的手段。
　　由于HLB菌無法進(jìn)行純培養(yǎng)，導(dǎo)致防治藥劑篩選工作進(jìn)展緩慢。本文以消毒劑作為HLB防治的候選藥劑，開展室內(nèi)防治藥劑篩選試驗

6、。將染病接穗浸泡不同消毒劑后，分別嫁接到砧木上，利用qPCR技術(shù)分析不同藥劑處理前后黃龍病菌濃度的變化，采用相對防效評價體系進(jìn)行評價，從而建立HLB防治藥劑的相對防效評價體系。結(jié)果表明，14種供試藥劑中有6種藥劑不適合此法；其余8種消毒劑能夠有效降低接穗黃龍病菌濃度，具有較高的相對防效。其中以三氯泡騰消毒片（TCCA）中有效氯含量為1250mg/L時，相對防效最佳，達(dá)到了88.9±0.47%。由于黃龍病菌在自然條件下會隨著季節(jié)的變化而發(fā)