鴨CYP7α1基因克隆及表達(dá)的研究.pdf

1、脂肪沉積是受微效多基因調(diào)控的數(shù)量性狀。鴨脂肪過(guò)多沉積會(huì)導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低及胴體品質(zhì)下降，一定程度上制約養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。同時(shí)人體攝入過(guò)多脂肪，易導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。膽固醇7α羥化酶(Cholesterol7 alpha-hydroxylase，CYP7α1)屬細(xì)胞色素P450酶類(lèi)功能性基因，大量研究證實(shí)，CYP7α1為脂類(lèi)代謝機(jī)制的重要候選基因，而鴨CYP7α1表達(dá)調(diào)控仍尚未見(jiàn)有報(bào)道。本研究以櫻桃谷鴨為試驗(yàn)對(duì)象，采用同源克隆及RACE技術(shù)成

2、功獲得CYP7α1基因全長(zhǎng)cDNA，通過(guò)基因工程方法構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并探討微生態(tài)制劑對(duì)該基因mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 1、鴨CYP7α1基因的克隆、表達(dá)及序列分析
　　 利用同源克隆及RACE技術(shù)，首次獲得鴨CYP7α1基因全長(zhǎng)cDNA序列，包括5'-UTR序列78bp、CDS全序列1539bp和3'-UTR序列666bp，編碼512個(gè)氨基酸。利用在線軟件對(duì)不同物種間CYP7α1基因CDS區(qū)序列進(jìn)行同源性比對(duì)、

3、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、生物信息學(xué)以及RT-PCR分析。結(jié)果表明:鴨CYP7α1基因的CDS序列與鵝的同源性最高，其次是雞，而與人、大鼠、小鼠、豬、牛的同源性不高。經(jīng)預(yù)測(cè)鴨CYP7α1蛋白可能含有一個(gè)P450超家族結(jié)構(gòu)域。RT-PCR結(jié)果顯示:鴨CYP7α1基因在肝臟中呈高豐度表達(dá)，在其他9個(gè)組織中均未檢測(cè)到或檢測(cè)到少量表達(dá)，表明該基因的表達(dá)具有組織特異性，為進(jìn)一步研究CYP7α1基因結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。
　　 2、鴨CYP7α1基因原

4、核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建pET32a-CYP7α1重組表達(dá)載體，在工程菌Rossetta-gami(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件給予優(yōu)化。研究結(jié)果表明:鴨CYP7α1蛋白在37℃，0.6mmol/L IPTG濃度條件下誘導(dǎo)4小時(shí)，在DE3菌中表達(dá)量最高，為進(jìn)一步研究該蛋白在脂類(lèi)代謝中的作用提供技術(shù)手段。
　　 3、鴨CYP7α1基因mRNA水平調(diào)控的初步研究
　　 采用單因子完全