水母雪蓮SmTTG1基因的克隆及表達研究.pdf

1、水母雪蓮（Saussurea medusa Maxim.），又稱水母雪兔子，屬菊科風毛菊屬，是一種生長于青藏高原地區(qū)的珍稀、瀕危藥用植物。同時，它又是一種典型的高山植物。植株密被表皮毛是水母雪蓮最具有代表性的形態(tài)特征，它是水母雪蓮對極端環(huán)境的一種適應結構。研究水母雪蓮表皮毛的形成和發(fā)育過程，對揭示高山植物適應環(huán)境的特殊機制將具有重要的理論意義。為此，本研究以水母雪蓮作為實驗材料，通過 RT-PCR，結合 RACE技術，克隆了與表皮毛發(fā)育

2、相關的基因TTG1，并研究了該基因的表達。
　　主要研究結果如下：
　　1.克隆到的水母雪蓮TTG1基因全長1346 bp，其中包括1014 bp的開放閱讀框，99 bp的5’端非編碼區(qū)，211 bp的3’端非編碼區(qū)，22 bp的ploy（A）尾巴。該基因共編碼337個氨基酸殘基，分子量為37.75 KD，等電點為4.88。同源比對顯示，水母雪蓮TTG1基因的核苷酸序列與同一科植物大麗花TTG1基因的核苷酸序列的同源性為75

3、％；推導出來的氨基酸序列與大麗花的同源性為83%，與擬南芥、煙草的同源性為74.56%、73.98%。通過SOPMA工具預測，水母雪蓮TTG1蛋白包含18.69%的α-螺旋，10.09%的β-轉角，43.03%的無規(guī)卷曲，28.19%的延伸鏈。無規(guī)卷曲和延伸鏈為該蛋白的主要二級結構。水母雪蓮TTG1基因的氨基酸序列有五個WD40 repeat，說明該基因可能編碼一種WD40蛋白，將該基因命名為SmTTG1（genbank accessi

4、on number:KX447632）。
　　2.采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，檢測β-actin、18SrRNA、GAPDH、EF和TUA五個基因在水母雪蓮根、莖、葉、花中的表達情況，運用geNorm、NormFinder和Bestkeeper三個軟件分析這5個基因在這4種組織內表達的穩(wěn)定性。結果顯示，在根、莖、葉、花中表達最穩(wěn)定的是18SrRNA。因此，18SrRNA可以作為水母雪蓮qRT-PCR的校正內參基因

5、。
　　3.以18SrRNA作為內參基因，運用qRT-PCR技術，測定SmTTG1在根、莖、葉、花中的表達情況。結果顯示，SmTTG1基因在4種組織中都有表達，其中在葉和花中的表達量最高。
　　4.將SmTTG1基因連接到pColdⅠDNA表達載體，并導入BL21（DE3）大腸桿菌中進行原核表達，表達產物用 SDS-PAGE電泳分析。結果顯示，目的蛋白在大腸桿菌中表達，表達蛋白的分子量大約是38KD，與由核苷酸序列推導的目的