耦合法分析玉米葉綠體Trx調(diào)節(jié)靶蛋白氧化還原態(tài)及其活性.pdf

1、氧化還原信號(hào)調(diào)節(jié)是一種主要的蛋白翻譯后修飾方式，它通過(guò)介導(dǎo)巰基和二硫鍵的可逆形成調(diào)節(jié)靶蛋白的活性，參與生物對(duì)外界環(huán)境的應(yīng)答、抵御逆境脅迫等多種生物過(guò)程，是近些年蛋白活性調(diào)節(jié)研究的熱點(diǎn)。植物中的氧化還原信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)主要存在于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線(xiàn)粒體內(nèi)，主要通過(guò)硫氧還蛋白(Trx)介導(dǎo)的氧化還原系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白活性的調(diào)節(jié)。葉綠體是植物光合作用的主要場(chǎng)所，其氧化還原系統(tǒng)比細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體更為復(fù)雜。玉米是C4作物，具有較高的光合作用效率，研究玉米

2、葉綠體氧化還原系統(tǒng)對(duì)玉米的高產(chǎn)、抗逆性等意義重大。本研究通過(guò)純化重組葉綠體氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)蛋白-依賴(lài)NADPH的鐵氧還蛋白還原酶(FNR)、硫氧還蛋白還原酶(NTR)等蛋白，研究葉綠體Trx對(duì)靶蛋白的調(diào)節(jié)效應(yīng)，建立體外分析Trx對(duì)靶蛋白調(diào)節(jié)效應(yīng)的技術(shù)體系，獲得了以下結(jié)果：
　　 1.克隆了玉米FNR2的編碼基因，構(gòu)建了3種分別帶有N端組氨酸標(biāo)簽、SUMO標(biāo)簽和C端組氨酸標(biāo)簽的FNR2基因大腸桿菌融合表達(dá)載體。在大腸桿菌中表達(dá)

3、并純化了重組玉米FNR2蛋白。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示：帶有N端組氨酸標(biāo)簽的FNR2蛋白在大腸桿菌中不表達(dá)；表達(dá)并純化的帶有C端組氨酸標(biāo)簽的FNR2蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示為一條主帶，亞基分子量大小約為35kD；帶有SUMO標(biāo)簽的FNR2通過(guò)ULP特異性切除SUMO標(biāo)簽，得到無(wú)標(biāo)簽的FNR2蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)顯示為一條主帶，亞基分子量大小約為35kD。通過(guò)對(duì)重組玉米FNR2蛋白的活性的分析顯示，帶有C端組氨酸標(biāo)簽的FNR

4、2蛋白的催化效率比無(wú)標(biāo)簽的FNR2蛋白提高約70％。
　　 2.克隆了用于對(duì)照系統(tǒng)中的擬南芥NTR的編碼基因，在大腸桿菌中表達(dá)重組擬南芥NTR蛋白并純化，SDS-PAGE顯示純化的NTR蛋白為一條主帶，亞基分子量大小約為35kD。分析重組擬南芥NTR蛋白的活性顯示，在NADPH存在下重組擬南芥NTR能還原DTNB，其還原能力隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在412nm的光吸收有明顯的增強(qiáng)。
　　 3.克隆了作為靶蛋白的玉米鎂-原卟啉Ⅸ螯合

5、酶I亞基(CHLI)的編碼基因，構(gòu)建了玉米CHLI的SUMO融合表達(dá)載體。在大腸桿菌中表達(dá)帶有SUMO標(biāo)簽的玉米CHLI蛋白，純化后通過(guò)ULP特異性切除SUMO標(biāo)簽，進(jìn)一步純化得到CHLI蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示CHLI蛋白為一條主帶，亞基分子量大小約為35kD。
　　 4.通過(guò)AMS標(biāo)記玉米CHLI的氧化還原態(tài)，經(jīng)非還原SDS-PAGE檢測(cè)顯示，經(jīng)葉綠體氧化還原系統(tǒng)調(diào)節(jié)的CHLI全部轉(zhuǎn)化為還原態(tài)。通過(guò)分析重組玉米CHL

6、I蛋白的活性顯示，經(jīng)葉綠體氧化還原系統(tǒng)調(diào)節(jié)后CHLI的ATP水解酶活性提高了約187％，比對(duì)照系統(tǒng)NADPH/NTR/Trx調(diào)節(jié)后的酶活性提高了約77％。
　　 5.經(jīng)Trxf介導(dǎo)的葉綠體氧化還原系統(tǒng)調(diào)節(jié)的靶蛋白玉米谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶(GSAT)的氧化還原態(tài)條帶發(fā)生明顯改變，還原態(tài)條帶濃度顯著增大，而Trxm介導(dǎo)的葉綠體氧化還原系統(tǒng)調(diào)節(jié)的GSAT的氧化還原態(tài)條帶未發(fā)生明顯改變。
　　 綜上所述，本研究建立了玉米葉