基于石蠟切片技術(shù)的家蠶胚胎發(fā)育與Mago蛋白定位研究.pdf

1、探索并建立適合家蠶卵的石蠟切片技術(shù)體系；獲得家蠶典型胚胎發(fā)育時(shí)期的顯微實(shí)體照片，印證補(bǔ)充前人關(guān)于家蠶胚胎發(fā)育的文字描述、示意圖或手繪圖，為家蠶胚胎發(fā)育基因功能研究提供形態(tài)學(xué)參考照片；探索并初步建立家蠶免疫組化技術(shù)體系，為在組織和細(xì)胞水平研究基因功能奠定基礎(chǔ)。 以KOH溶液作為卵殼軟化液，設(shè)置濃度梯度和軟化時(shí)間梯度，摸索最佳軟化時(shí)間；摸索適合家蠶卵的固定、透明、染色方法；利用已建立的石蠟切片技術(shù)體系，以不同發(fā)育時(shí)期的家蠶日系N4品

2、種非滯育卵為材料進(jìn)行石蠟切片，獲得較為系統(tǒng)的典型胚胎發(fā)育時(shí)期的顯微實(shí)體照片；以家蠶日系N4品種5齡3天幼蟲精巢為材料，以家蠶Mago蛋白IgG為Ⅰ抗，摸索免疫組化方法，建立免疫組化技術(shù)體系，獲得家蠶Mago蛋白組織定位信息。研究結(jié)果如下：1.以家蠶日系N4品種非滯育卵為材料，用10％KOH溶液軟化卵殼5min，用Smith液固定，用松油醇(Terpineo1)脫水兼透明，建立了家蠶卵石蠟切片技術(shù)體系。 2.獲得了較為系統(tǒng)的家蠶典

3、型胚胎發(fā)育時(shí)期的實(shí)體照片，這些時(shí)期包括胚盤形成、胚帶形成、中胚層分化、頭胸部突起顯現(xiàn)、腹部突起顯現(xiàn)、反轉(zhuǎn)前、反轉(zhuǎn)、反轉(zhuǎn)后、器官形成等典型發(fā)育時(shí)期。還觀察到了卵黃細(xì)胞的形成過程，區(qū)分了合胞體胚盤和細(xì)胞胚盤，得到了胚胎中腸、背血管、神經(jīng)索、生殖腺、絲腺等組織圖片。用連續(xù)切片技術(shù)觀察到了類原始生殖細(xì)胞存在于中胚層突起處。 3.影響免疫組化結(jié)果的因素主要有抗體的純度，Ⅰ抗和Ⅱ抗最佳稀釋度組合，抗原修復(fù)、封閉、洗滌、抗體孵育、顯色等步驟的

4、時(shí)間等。本研究確定的Ⅰ抗和Ⅱ抗最佳稀釋度組合為Ⅰ抗1∶1000，Ⅱ抗1∶500。 4.家蠶Mago蛋白精巢組織的免疫定位結(jié)果表明，家蠶Mago蛋白存在于整個(gè)精巢組織中，但主要位于精母細(xì)胞、精子束細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。 總之，通過本研究，建立了一套家蠶卵石蠟切片技術(shù)體系，具有簡(jiǎn)便、快速、完整性好、能大批量進(jìn)行切片等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足家蠶胚胎發(fā)育基因功能研究的需要；獲得了較為系統(tǒng)的家蠶典型胚胎發(fā)育時(shí)期的實(shí)體照片，印證補(bǔ)充