番茄,辣椒和胡蘿卜的精細(xì)胞以及卵細(xì)胞的分離.pdf

1、高等植物的卵細(xì)胞深藏在子房內(nèi)的胚珠體細(xì)胞組織中,而精細(xì)胞位于花粉營養(yǎng)細(xì)胞中。受精過程和胚胎發(fā)生過程則在珠心內(nèi)的胚囊中完成,這對(duì)高等植物受精機(jī)理研究形成了很大的障礙。而將高等植物的精、卵細(xì)胞和其他雌配子體細(xì)胞分離出來,在體外誘導(dǎo)精、卵細(xì)胞的融合以及對(duì)人工合子和其他分離得到的雌配子細(xì)胞體外進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究可克服這種障礙。
　　 本實(shí)驗(yàn)中,我們嘗試分離番茄、辣椒和胡蘿卜具有生活力的精、卵細(xì)胞,為進(jìn)一步的研究番茄、辣椒和

2、胡蘿卜雌雄配子體的分子生物學(xué)特性及受精機(jī)理等提供了條件。
　　 1.番茄精、卵細(xì)胞的分離:番茄的花粉屬于二胞型。本實(shí)驗(yàn)采用直接爆破花粉粒的方法分離具生活力的生殖細(xì)胞,并收集成群體。嘗試離體萌發(fā)花粉管及活體一離體培養(yǎng)花粉管,成功分離到具生活力的精細(xì)胞。以開花當(dāng)天的胚珠為材料,用酶解—解剖法分離得到一定數(shù)量的卵細(xì)胞、助細(xì)胞及中央細(xì)胞。在最佳條件下,30分鐘可從70個(gè)胚珠中分離出7個(gè)卵細(xì)胞。通過微吸管進(jìn)行收集,在短時(shí)間內(nèi)可得到一定數(shù)量

3、的卵細(xì)胞及助細(xì)胞群體。對(duì)分離胚囊細(xì)胞的最佳滲透壓條件和酶液成分、含量進(jìn)行了篩選。
　　 2.辣椒精、卵細(xì)胞的分離:辣椒的花粉屬于二胞型。本實(shí)驗(yàn)采用直接爆破花粉粒的方法分離具生活力的生殖細(xì)胞,并收集成群體。并采用活體一離體法培養(yǎng)花粉管,成功分離到具生活力的精細(xì)胞。辣椒的子房內(nèi)有多個(gè)胚珠,取開花當(dāng)天的胚珠,嘗試用酶解一解剖法分離胚囊細(xì)胞。在最佳條件下,30分鐘可從54個(gè)胚珠中分離到6個(gè)卵細(xì)胞。分離的辣椒卵細(xì)胞經(jīng)FDA染色后,熒光顯微

4、鏡下觀察其呈明亮的綠色熒光,表明其具有較強(qiáng)的生活力,而部分卵器中兩個(gè)助細(xì)胞其熒光的強(qiáng)弱存在明顯的差異。用顯微操作儀可收集到一定數(shù)量的卵細(xì)胞,以作為進(jìn)一步研究辣椒卵細(xì)胞的分子生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料。
　　 3.胡蘿卜精、卵細(xì)胞的分離:胡蘿卜花粉屬于三胞型。在多種爆破液中,花粉粒都沒有反應(yīng)。用兩個(gè)解剖針擠壓胡蘿卜花粉粒使其破裂釋放出精細(xì)胞,達(dá)到分離、收集胡蘿卜精細(xì)胞的目的。用酶解一解剖方法分離胡蘿卜胚囊中的卵細(xì)胞、助細(xì)胞和中央細(xì)胞。胡

5、蘿卜胚珠先在酶液中酶解40-50 min,然后將其轉(zhuǎn)移到不含酶的分離液中用解剖針解剖胚珠。將胚珠的合點(diǎn)端切破,輕輕擠壓胚珠的珠孔,卵細(xì)胞、助細(xì)胞和中央細(xì)胞即可逸出。在最佳條件下,20分鐘可從20個(gè)胚珠中分離出5個(gè)卵細(xì)胞。對(duì)分離胚囊細(xì)胞的滲透壓和酶液成分進(jìn)行了篩選。分離出的胡蘿卜精、卵細(xì)胞用顯微操作儀收集到一定數(shù)量,以作為進(jìn)一步研究胡蘿卜卵細(xì)胞的分子生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料備進(jìn)一步用。
　　 目前被子植物離體受精技術(shù)只在玉米和水稻兩種