藍(lán)豬耳精、卵細(xì)胞，中央細(xì)胞，助細(xì)胞以及原胚細(xì)胞的分離.pdf

1、高等植物的雌性配子細(xì)胞深藏在子房?jī)?nèi)的胚珠體細(xì)胞組織中，形成了對(duì)高等植物受精機(jī)理研究的障礙。而將高等植物的精、卵細(xì)胞和其他雌配子體細(xì)胞分離出來(lái)，在體外誘導(dǎo)精、卵細(xì)胞的融合以及對(duì)人工合子和其他分離得到的雌配子細(xì)胞體外進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的研究可克服這種障礙，達(dá)到研究高等植物受精機(jī)理的目的。分離的雌、雄配子、合子以及早期胚細(xì)胞結(jié)合分子生物學(xué)方法研究這些細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能已成為一個(gè)新的研究領(lǐng)域。藍(lán)豬耳(Torenia fournieri)具有胚

2、囊半裸露的特點(diǎn)，近幾年來(lái)逐漸成為研究植物受精生物學(xué)的一種模式植物。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們分離了一定數(shù)量具有生活力的精、卵細(xì)胞、中央細(xì)胞、助細(xì)胞、以及二胞原胚中的頂細(xì)胞與基細(xì)胞。 1.藍(lán)豬耳精細(xì)胞分離：藍(lán)豬耳成熟花粉是二胞型。我們采用活體-離體技術(shù)培養(yǎng)了藍(lán)豬耳的花柱使其長(zhǎng)出花粉管，然后用滲透壓沖擊法促使花粉管尖端破裂，釋放出一對(duì)與營(yíng)養(yǎng)核相連的精細(xì)胞。通過(guò)對(duì)45對(duì)精細(xì)胞直徑大小進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)豬耳的一對(duì)精細(xì)胞在體積上呈顯著差

3、異，具有二型性。并首次發(fā)現(xiàn)，爆破出的兩個(gè)精細(xì)胞的生活力也是有所差異的，經(jīng)FDA染色時(shí)發(fā)現(xiàn)，和營(yíng)養(yǎng)核相連大的精細(xì)胞(Svn)的熒光明顯弱于小的精細(xì)胞(Sua)。對(duì)大小兩個(gè)精細(xì)胞進(jìn)行了群體的收集。 2.藍(lán)豬耳卵細(xì)胞和合子分離：在準(zhǔn)確掌握了藍(lán)豬耳胚囊發(fā)育的時(shí)期和授粉至受精時(shí)間的基礎(chǔ)上，分離出大量生活狀態(tài)良好的卵細(xì)胞與合子；觀察了體內(nèi)卵細(xì)胞與助細(xì)胞受精前后的一些細(xì)胞學(xué)變化；對(duì)于體內(nèi)合子從受精起始到分裂為二胞原胚的一系列變化也進(jìn)行了觀察。

4、同時(shí)還發(fā)現(xiàn)花粉管進(jìn)入胚囊后，在藍(lán)豬耳胚珠內(nèi)部形成了一條淀粉粒帶，而在受精前的胚珠中完全不存在這條淀粉粒條帶，這是由受精引起的雌性器官內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化。我們首次對(duì)高等植物分離后的卵細(xì)胞與合子進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)卵細(xì)胞與合子表面都帶正電荷。在電場(chǎng)作用下，細(xì)胞的移動(dòng)速度主要取決于其表面電荷的多少。在實(shí)驗(yàn)中，合子的移動(dòng)速度比卵細(xì)胞快，暗示受精后，合子所帶的表面電荷增加。卵細(xì)胞與合子的大量分離為高等植物受精機(jī)理的研究創(chuàng)造了條件。 3.藍(lán)豬耳中

5、央細(xì)胞和助細(xì)胞分離：在對(duì)以上分離技術(shù)不斷完善和改進(jìn)的基礎(chǔ)上，我們分離出了受精前后的中央細(xì)胞以及不同時(shí)期的助細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受精前后的中央細(xì)胞在體積與細(xì)胞狀態(tài)均有很大差異，受精前的中央細(xì)胞體積較小，含有很多大液泡，且細(xì)胞內(nèi)部的淀粉粒較少；而受精后的中央細(xì)胞體積變大，液泡減少，細(xì)胞內(nèi)部充滿了淀粉粒。通過(guò)比較不同發(fā)育時(shí)期的助細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)助細(xì)胞只是在體積上略有差異，而在細(xì)胞狀態(tài)上看不出任何差異。 4.藍(lán)豬耳二胞原胚的頂細(xì)胞和基細(xì)胞分離