基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選膀胱癌相關(guān)蛋白的研究.pdf

1、膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率及復(fù)發(fā)后腫瘤級別進(jìn)展的特性，超過70％的患者在接受膀胱鏡下腫瘤切除術(shù)后2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，且其臨床分期及病理級別出現(xiàn)進(jìn)展。因此，臨床上針對膀胱癌術(shù)后患者需進(jìn)行密切的隨訪復(fù)查及輔助治療。然而目前仍缺乏敏感特異的膀胱癌分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步篩查和鑒定新型膀胱癌診斷與監(jiān)測分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，并建立其國人膀胱癌預(yù)后預(yù)測及腫瘤監(jiān)測分子標(biāo)志物體系，對改善膀胱癌患者的預(yù)后具有重要意義。本文從

2、以下幾部分進(jìn)行了闡述。
　　第一部分基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選的CRABP2與FABP5蛋白質(zhì)分子是膀胱癌新型的潛在性腫瘤標(biāo)志物。
　　目的:
　　膀胱癌目前仍缺乏敏感特異的診斷與術(shù)后隨訪監(jiān)測分子標(biāo)志物。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選及鑒定腫瘤分子標(biāo)志物是熱門且有效的方法。本研究旨在運(yùn)用雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)篩選及鑒定國人膀胱癌新型的敏感特異性

3、分子標(biāo)志物。
　　方法:
　　隨機(jī)選取3例病理診斷為膀胱尿路上皮癌的腫瘤組織標(biāo)本及配對的癌旁正常膀胱粘膜標(biāo)本，將提取的組織蛋白用Cy2，Cy3與Cy5熒光標(biāo)記后進(jìn)行2D-DIGE，獲得二維蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜并進(jìn)行差異分析。選取在3對組織標(biāo)本均存在顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)用于MALDI-TOF/TOF MS分析，篩選出新型的潛在性膀胱癌分子標(biāo)志物。然后在32例膀胱尿路上皮癌組織標(biāo)本中應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡方法(WesternBlot)進(jìn)行驗(yàn)證

4、及分析。
　　結(jié)果:
　　通過對2D-DIGE獲得的二維蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜進(jìn)行差異分析，共發(fā)現(xiàn)71個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均在3例膀胱尿路上皮癌的腫瘤組織及配對癌旁正常粘膜組織中存在顯著差異性表達(dá)，其中63個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)采用MALDI-TOF/TOF MS分析并成功鑒定。發(fā)現(xiàn)有21種蛋白質(zhì)分子在膀胱癌組織中顯著異常高表達(dá)，其中有兩個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定為CRABP2與
　　FABP5。通過在32例膀胱癌組織標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證分析，發(fā)現(xiàn)CRABP2與FAB

5、P5兩種蛋白質(zhì)分子在腫瘤標(biāo)本中均為顯著異常高表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　CRABP2與FABP5在膀胱癌中異常高表達(dá)，是國人膀胱癌新型的潛在性腫瘤標(biāo)志物。
　　第二部分線粒體融合蛋白2在膀胱癌中的抗腫瘤作用及其機(jī)制研究.
　　目的:
　　Mfn2基因通過腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染在肺癌細(xì)胞株A548和結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29中高表達(dá)具有顯著的抗腫瘤作用，但其在膀胱癌中的作用仍未明確。本實(shí)驗(yàn)通過研究高表達(dá)的Mfn2對膀胱癌T2

6、4和5637細(xì)胞生長的作用，闡明Mfn2在膀胱癌中的抗腫瘤作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-PCR，RT-PCR）和免疫印跡方法(western blot analysis)檢測36對膀胱癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本中Mfn2的表達(dá)。通過含有完整Mfn2基因的腺病毒載體（Ad-Mfn2）將Mfn2基因轉(zhuǎn)染至膀胱癌細(xì)胞內(nèi)，以含編碼綠色熒光蛋白的基因的腺病毒載體(

7、Ad-GFP)作為對照，運(yùn)用RT-PCR、免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)等方法觀察Mfn2表達(dá)情況、細(xì)胞周期分布以及與細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織。Ad-Mfn2具有顯著抑制T24和5637細(xì)胞增殖的作用。高表達(dá)Mfn2的T24細(xì)胞其細(xì)胞周期明顯阻滯于G0/G1期，并通過激活caspase-3和PARP引起細(xì)胞凋亡，同時(shí)引起周期相關(guān)蛋白p21和p2