醋酸甲孕酮單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、醋酸甲孕酮（Medroxyprogesterone Acetate，MPA）是一種人工合成的激素，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，曾被用作動物生長促進劑。由于醋酸甲孕酮有致乳腺癌的作用，我國和歐盟已禁止在動物性食品生產(chǎn)中使用該藥物。國內外已建立了很多理化方法檢測動物性食品中殘留的醋酸甲孕酮。雖然有些方法比較靈敏精確，但由于花費大、時間長、技術要求高等原因而不適合大批量樣品的篩選。作為一種快速、靈敏、特異的方法，酶聯(lián)免疫吸附測定正逐漸應用于藥物的殘留檢測

2、。本研究通過抗原的合成和抗體的制備，建立了MPA的ELISA測定方法。
　　 本文采用O-（羧甲基）羥胺法合成醋酸甲孕酮-3-（O-羧甲基）肟（MPS）半抗原。用二環(huán)己基碳化二亞胺偶聯(lián)法分別將醋酸甲孕酮-3-（O-羧甲基）肟與牛血清白蛋（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)合成人工完全免疫原和包被抗原。用紫外掃描和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對人工抗原進行初步鑒定，確定偶聯(lián)成功。分光光度法估算MPS-BSA、MPS-OVA中半抗原與

3、載體蛋白的偶聯(lián)比率，最后測MPS-BSA的偶聯(lián)比為19：1；MPS-OVA偶聯(lián)比為18：1。
　　 用人工合成的醋酸甲孕酮．牛血清白蛋白（MPA-BSA）作為抗原免疫BALB/C小鼠4次后，間接ELISA測定免疫小鼠體內的MPA抗體效價，取1只免疫效果最佳小鼠的脾細胞，在PEG作用下與SP2/0細胞融合，利用雜交瘤技術篩選得到2株穩(wěn)定分泌醋酸甲孕酮單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C11A386和4C11G8H6。對這兩株細胞的上清和腹

4、水進行效價測定，其細胞培養(yǎng)上清效價分別為1：640和1：320，腹水效價分別為1：2.56×106和1：1.6×106。對兩株單抗進行鑒定：雜交瘤細胞染色體數(shù)分別為99.64±1.5和99.35±1.5，其分泌的抗體亞型均為IgG2a。將兩株細胞經(jīng)體外傳代和多次凍存復蘇后，其抗體分泌穩(wěn)定。
　　 利用4C11A386雜交瘤細胞株的腹水單抗建立檢測醋酸甲孕酮殘留的間接競爭ELISA方法。繪制出醋酸甲孕酮間接競爭ELISA檢測方法的

5、標準曲線：y=-30.022LogC+90.191，R2=0.9911，此方法可測定的最適范圍為1～100ng/mL；ciELISA檢測顯示其IC50為22ng/mL。在可測定范圍內，孔雀石綠、無色孔雀石綠、己烯雌酚、四環(huán)素、恩諾沙星、呋喃唑酮、呋喃西林、氯霉素、青霉素等可能會因為同時使用而導致共同殘留的藥物未顯示交叉反應性，表明該單抗具有較好的敏感性和特異性。
　　 本研究通過將MPA轉化為人工抗原，免疫小鼠，成功地制備出了醋