環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)屬于氟喹諾酮類抗菌藥物,因其藥物吸收迅速、生物利用度高、體內(nèi)分布廣泛、耐藥性產(chǎn)生慢且與其他抗生素?zé)o交叉耐藥反應(yīng),廣譜而高效,被廣泛用于獸醫(yī)臨床和畜牧生產(chǎn),用于治療動(dòng)物疾病和作為飼料添加劑使用。但環(huán)丙沙星作為一種人畜共用藥,藥物殘留通過(guò)食物鏈對(duì)人體危害極大,不利于將該類藥物應(yīng)用于人類疾病的治療。美國(guó)、歐盟、中國(guó)等均對(duì)動(dòng)物源性食品中環(huán)丙沙星殘留限量做了禁用或限用的規(guī)定。為了監(jiān)測(cè)畜產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的

2、殘留,建立一種快速檢測(cè)環(huán)丙沙星殘留的方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 ELISA憑借特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速的優(yōu)點(diǎn),普遍應(yīng)用于藥物的殘留檢測(cè)。本研究運(yùn)用化學(xué)合成方法制備CIP完全抗原,采用單克隆抗體技術(shù)制備了靈敏度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高的抗體,并建立CIP的CiELISA測(cè)定方法。雞肝臟加標(biāo)回收試驗(yàn)證明,建立的檢測(cè)CIP殘留的CiELISA是穩(wěn)定、可靠的。
　　 1.CIP完全抗原的合成與鑒定
　　 采用N-羥基

3、琥珀酰亞胺活性酯(NHS)法和混合酸酐法將CIP與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)進(jìn)行偶聯(lián),制備人工抗原CIP-BSA和CIP-OVA。通過(guò)紫外掃描初步判定兩種完全抗原CIP-BSA和CIP-OVA偶聯(lián)成功。
　　 2.CIP單抗的制備
　　 用NHS法合成的CIP-BSA為免疫原免疫BALB/c小鼠,混合酸酐法合成的CIP-OVA為檢測(cè)原。五免后陽(yáng)性血清效價(jià)為1:6,000左右。利用雜交瘤技術(shù)獲得1株

4、可持續(xù)分泌針對(duì)藥物CIP抗體的雜交瘤細(xì)胞株6E4。采用體內(nèi)誘生法,將細(xì)胞株6FA接種到小鼠體內(nèi),制備了抗CIP的腹水。其蛋白濃度為26.5mg/mL,腹水效價(jià)為1:24,000。
　　 3.ELISA檢測(cè)方法的建立
　　 通過(guò)建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,測(cè)定腹水最佳工作濃度在1:20,000。用6FA制備的腹水作出的CIP藥物抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性方程為Y=0.5611x-0.0748(R2=0.9904),IC50為10

5、.58ng/mL,LOD低于2ng/mL,LOQ為5.32ng/mL。交叉實(shí)驗(yàn)表明,該單抗對(duì)CIP的抑制率為100％,對(duì)恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星的交叉反應(yīng)率分別為34.6％、68.4％、13.4％,與其他非喹諾酮類抗生素鏈霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲嗯唑無(wú)交叉反應(yīng)。
　　 4.添加回收試驗(yàn)
　　 將建立的CiELISA初步應(yīng)用于雞肝添加回收試驗(yàn)。當(dāng)雞肝樣品液作1.6倍以上稀釋時(shí),基本無(wú)基質(zhì)干擾。在4～25ng/mL范圍