農(nóng)桿菌介導(dǎo)非抗生素標(biāo)記的抗逆基因BADH轉(zhuǎn)化大豆的研究.pdf

1、大豆的生長發(fā)育受外界環(huán)境影響很大，尤其是非生物脅迫因素如干旱、鹽堿、凍害、低溫等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致大幅度的減產(chǎn)甚至絕收。因此增加大豆的抗逆性是大豆改良的重要目標(biāo)，同時(shí)對(duì)緩解我國大豆產(chǎn)業(yè)危機(jī)具有十分重要的意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)日益成為植物耐逆育種的主要方法。
　　 本研究以浙江省杭州國家大豆改良分中心保存的‘浙春3號(hào)’、‘H0302’和‘57001’為研究材料，將抗逆基因BADH構(gòu)建到非抗生素標(biāo)記的植物表達(dá)

2、載體pBA002內(nèi)，并將其導(dǎo)入大豆基因組中表達(dá)產(chǎn)生甜菜堿醛脫氫酶。甜菜堿醛脫氫酶可以清除由于非生物脅迫而在體內(nèi)產(chǎn)生的有毒害作用的甜菜堿醛，積累大量的甜菜堿。它是一種高效的滲透調(diào)節(jié)劑，從而提高大豆的耐逆性，以期獲得具有抵抗鹽害、干旱等非生物脅迫能力的大豆新種質(zhì)。隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物逐漸商品化，轉(zhuǎn)基因作物中選擇標(biāo)記基因存在的生物安全性問題越來越引起人們的關(guān)注，構(gòu)建一個(gè)不含抗生素類選擇標(biāo)記的安全的植物表達(dá)載體，顯得尤為重要。本文擬構(gòu)建含耐逆相關(guān)B

3、ADH基因且不以抗生素為篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體，進(jìn)而為獲得耐逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因材料做準(zhǔn)備。建立和優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系是成功獲得轉(zhuǎn)基因大豆的首要前提，本實(shí)驗(yàn)主要采用大豆子葉節(jié)和帶一片子葉胚芽尖作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的外植體，并研究影響遺傳轉(zhuǎn)化的重要影響因子。主要研究成果如下:
　　 1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出甜菜堿醛脫氫酶基因BADH，并于上下游引物端分別添加Xhol和SacⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基序列;TA克隆PCR產(chǎn)物至p

4、TA2并進(jìn)行測序驗(yàn)證;雙酶切經(jīng)過測序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒pTA2-BADH和植物表達(dá)載體pBA002，分別回收目的基因和pBA002載體片段，并進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，然后進(jìn)行雙酶切、PCR擴(kuò)增和進(jìn)一步的測序驗(yàn)證。結(jié)果表明BADH基因已被完整、正確的插入到pBA002載體中，成功構(gòu)建了含BADH和Bar基因的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步的植物遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的優(yōu)化。本文以大豆品種‘浙

5、春3號(hào)’的子葉節(jié)為受體材料，主要研究了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、6-BA對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的影響。結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)子葉節(jié)叢生芽誘導(dǎo)率的具有較大影響。其中預(yù)培養(yǎng)時(shí)間影響尤為顯著，侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間影響不顯著。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間21h，侵染時(shí)間70min，共培養(yǎng)時(shí)間為3d時(shí)，叢生芽誘導(dǎo)率最高為86.5％。6-BA在大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)恢復(fù)階段起著重要的作用。以叢生芽誘導(dǎo)率為指標(biāo)，在恢復(fù)培養(yǎng)基

6、中添加1.5mg/L6-BA時(shí)誘導(dǎo)效果最好，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)到最大值88.8％。此外，我們以‘浙春3號(hào)’、‘57001’和‘H0302’為受體材料，研究了基因型的影響。結(jié)果顯示，在大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化再生體系中具有顯著的基因型效應(yīng)。3個(gè)基因型叢生芽誘導(dǎo)率差異顯著。其中‘浙春3號(hào)’叢生芽率最高，達(dá)86.68％;其次為‘57001’80.78％，最少為‘H0302’僅48.92％。
　　 3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆帶一片子葉胚芽尖遺傳轉(zhuǎn)化再生