豬嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢測試劑盒組裝及漢賽巴爾通體間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬嗜血支原體（Mycoplasma haemosuis，M.suis）是一種寄生于紅細胞表面的病原微生物，臨床上慢性感染表現(xiàn)為輕度貧血，消瘦，繁殖機能障礙等，急性病例死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失，但目前血清學診斷技術研究較少，尚無商品化試劑盒。因此，研究豬嗜血支原體的血清診斷試劑盒非常重要。MSG1蛋白是M.suis的一種重要的表面黏附蛋白，具有良好的免疫原性。本研究在實驗室已建立的豬嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢測方法的基礎

2、上，成功組裝試劑盒，并對其性能進行測定。
　　漢賽巴爾通體（Bartonella henselae，B.henselae）是目前已知的致病種類最多的巴爾通體，是貓抓病(SCD)的病原體，17-kDa蛋白是漢賽巴爾通體中能夠誘導機體產(chǎn)生免疫應答的較少蛋白之一，適合用來建立檢測方法。
　　本研究具體內(nèi)容如下:
　　1.豬嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢澍試劑盒各組分的制備與質(zhì)量檢測
　　本研究在實驗室已建立的豬嗜血支原

3、體阻斷ELISA抗體檢測方法的基礎上，對試劑盒各個組份進行制備，并進行質(zhì)量檢測。試驗結果表明，純化后獲得的重組MSG1蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在45kDa處有明顯的表達帶，無明顯雜帶，且抗原性良好，三批蛋白的濃度均為0.5mg/mL以上，能用于試劑盒的制備;包被MSG1蛋白抗原包被板、陰陽性對照血清、酶標抗體、稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液經(jīng)性狀檢驗、無菌檢驗及效價檢驗顯示均具有良好的性質(zhì)，能用于試劑盒的組裝。
　　2.豬

4、嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢測試劑盒的組裝與保存
　　本研究用保護劑分別處理ELISA方法中的關鍵試劑，然后組裝成試劑盒。進行37℃加速試驗及實時實溫試驗，測定其保存期。結果為:試劑盒各組份在37℃進行加速破壞試驗時，均能表現(xiàn)良好的穩(wěn)定性;將各組份組裝成試劑盒后，37℃加速7d基本能保存穩(wěn)定，實時實溫試驗證明在4℃保存6個月能基本保持穩(wěn)定。以上結果表明，該試劑盒具有一定的穩(wěn)定性，為試劑盒最終開發(fā)提供了數(shù)據(jù)基礎。
　　3.豬

5、嗜血支原體血清流行病學調(diào)查
　　本研究采用阻斷ELISA方法對來自7個?。▍^(qū)）的1492份豬血清進行了檢測并對其感染的時間、空間和種群間的分布進行了分析。結果表明:血清抗體總陽性率為17.36％，其中上海地區(qū)最高為57.01％，廣西地區(qū)最低為4.55％，安徽、浙江、江蘇、江西和四川分別為28.40％、20.25％、13.93％、7.14％和5.49％。感染時間從6、7月份開始，9月份感染比例達到最高(33.94％)，然后開始慢慢下

6、降。種群間分析顯示母豬血清陽性率為65.48％，仔豬為4.8％。血清流行病學調(diào)查結果顯示豬嗜血支原體在我國豬群的感染比較普遍，而且呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢。
　　4.漢賽巴爾通體17-kDa間接ELISA方法的建立
　　本研究將漢賽巴爾通體17-kDa蛋白基因按大腸桿菌密碼子偏嗜性改造后進行全基因人工合成，然后將目的基因克隆到原核表達載體pET-28a中，構建重組質(zhì)粒pET-28a-17kDa，導入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，

7、進行誘導表達并用Ni-NTA純化試劑進行純化;純化后的蛋白應用His單抗進行鑒定。以17-kDa蛋白作為包被抗原及優(yōu)化ELISA反應條件，建立檢測抗?jié)h賽巴爾通體17-kDa蛋白抗體的間接ELISA方法:抗原包被量0.4μg/mL，37℃包被2h后4℃過夜，1％BSA37℃封閉3h，待檢血清稀釋度1∶100后37℃孵育1h，二抗1∶15000稀釋，37℃作用30min，抗體臨界值為OD450≥0.392判為陽性，OD450≤0.3326判

8、為陰性，介于二者之間為可疑。與豬嗜血支原體、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬口蹄疫病毒等血清抗體無交叉反應，批間和批內(nèi)重復性較好，對379份血清樣品進行檢測，抗體陽性檢出率達51.72％。說明該方法可用于漢賽巴爾通體抗體檢測和流行病學調(diào)查。
　　綜上所述，本研究成功組裝了豬嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，通過試驗證明該試劑盒在2-8℃保存6個月能基本保持穩(wěn)定，為該試劑盒的最終產(chǎn)業(yè)化提供了實驗