丁香假單胞大豆致病變種hrpZ基因的克隆及編碼蛋白的純化與功能研究.pdf

1、大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病是我國尤其是北方大豆產(chǎn)區(qū)的一種重要病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失，其病原物為丁香假單胞大豆致病變種（Pseudomonas syringae pv.glycinea）是世界范圍內(nèi)重要的植物病原細(xì)菌。同其他革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌一樣，大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌可以在非寄主植物和抗病植物上激發(fā)過敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR），在感病寄主上具有致病性（pathogenicity），這一特性由細(xì)菌中hrp基

2、因簇決定。hrp基因簇的特定基因編碼產(chǎn)物harpin是一類可以在非寄主植物上激發(fā)HR的非特異性蛋白激發(fā)子，是目前研究得較為深入的一類細(xì)菌分泌蛋白。目前，對于大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌harpin蛋白編碼基因hrpZ的功能研究甚少，國外只在Race4和Psg r0菌株中克隆和表達(dá)harpin蛋白。國內(nèi)研究人員克隆并表達(dá)來自Psg12菌株中的harpin蛋白，與國外報道的hrpZ基因同源性為79％。由此，我們推斷來自丁香假單胞大豆致病變種harpi

3、n編碼基因可能存在多樣性，其編碼的harpin蛋白的活性和功能也可能存在差異。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期從北方大豆產(chǎn)區(qū)分離和鑒定了7株大豆細(xì)菌牲斑點(diǎn)病菌，并對病原菌的Ⅲ型效應(yīng)分子進(jìn)行了研究。在此基礎(chǔ)上，本文從A1和S1菌株中克隆了harpin編碼基因，命名為hrpZ(P)sgS1和hrpZPsgS1，通過生物信息學(xué)分析，確定harpinZPagA1和harpinZPsgS1屬于harpin家族第三組群，假單胞組群。并且，可將來自丁香假

4、單胞大豆致病變種hrpZ基因分為兩類，這兩類hrpZ基因的核苷酸同源性為79％，氨基酸同源性為77％，均富含甘氨酸，不舍半胱氨酸，富含保守的LIHEKLGDNFGASA功能序列，與假單胞菌屬以外的其他革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌不存在相似性。本研究豐富了世界范圍內(nèi)來源于P.syringae的hrpZ基因資源，補(bǔ)充了我國來源于丁香假單胞大豆致病變種的hrpZ基因資源。
　　 為了了解來自A1和S1菌株harpin蛋白的生物活性和生物學(xué)功

5、能，本研究利用GST基因操作系統(tǒng)獲得了hrpPsgA1和hrpZPsgS1的基因產(chǎn)物，分別命名harpinZPsgA1和harpinZPsgS1，對harpinZPsgS1進(jìn)行了純化，每升BL21/pET41a(+)-hrpZPsgS1發(fā)酵液經(jīng)High-Affinity GST Resin純化，可提純harpinZPsgS1蛋白約20mg。純化的harpin蛋白為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和功能提供了更為有利的基礎(chǔ)。
　　 生物活性測定結(jié)

6、果顯示，harpinZPsgS1對熱穩(wěn)定，對蛋白K敏感，可以在非寄主植物煙草上激發(fā)過敏反應(yīng)，并且過敏反應(yīng)可以被真核生物代謝抑制劑所抑制，具備harpin蛋白的生物學(xué)特征。harpinZPsgS1激發(fā)HR的最小濃度為100μg/ml，低濃度的harpinZPsgS1雖然不能激發(fā)肉眼可見的HR，但可以激發(fā)micro-HR。
　　 外施harpinZPsgS1可以促進(jìn)煙草的生長，顯著提高煙草對TMV和疫霉的抗性，而且抗性不僅局限于ha

7、rpinZPsgS1處理的葉片，也包括其它未處理葉片及整株植物，是一種系統(tǒng)獲得抗性。harpinZPsgS1激發(fā)的HR伴隨著HCD標(biāo)志基因hsr203J、hsr515的表達(dá)，同時伴隨SAR正調(diào)控因子NPR1，植保素合成限速酶基因Pal，PR蛋白家族基因PR-1a、Chia5的表達(dá)，但未檢測到乙烯信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E1N2的表達(dá)，進(jìn)一步說明harpinZPsgS1誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生的SAR是依賴于水楊酸信號途徑的。
　　 不同植物病