新城疫病毒HN蛋白單克隆抗體的制備及分離株HN蛋白抗原表位差異性分析.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由副粘病毒科、禽腮腺炎病毒屬中的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的多種禽類發(fā)生感染和死亡的一種急性、接觸性傳染病。從1920年代到現(xiàn)在，NDV已經(jīng)在世界范圍內(nèi)引起了四次大的流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。新城疫病毒粒子囊膜表面包含兩種類型的糖蛋白：血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase protein,HN

2、)和融合蛋白(fusion protein,F)。HN蛋白與病毒的毒力及致病性密切相關(guān)，是主要的保護(hù)性抗原，在NDV的研究中具有非常重要的意義。盡管NDV只有一個(gè)血清型，但不同亞型的病毒間存在較大的抗原差異。單克隆抗體具有針對(duì)單個(gè)抗原決定簇的特異性，可以識(shí)別不同的抗原位點(diǎn)，因此可以用來檢測(cè)不同毒株之間抗原的差異性。
　　 本文分別用全病毒和真核表達(dá)質(zhì)粒作為免疫原，免疫小鼠后制備了針對(duì)HN蛋白不同抗原表位的單抗，然后用單抗對(duì)不同時(shí)

3、間、不同來源、不同基因型的NDV毒株進(jìn)行排譜反應(yīng)，進(jìn)而分析了不同NDV毒株HN蛋白間的抗原差異。
　　 ⑴全病毒免疫原的純化以及核酸免疫原的構(gòu)建。JS/05/5/Go毒株接種10日齡SPF雞胚，37℃孵化以擴(kuò)增病毒，雞胚死亡后收集尿囊液，離心純化后作為免疫原；同時(shí)，已有的研究證實(shí)HN蛋白的大多數(shù)功能位點(diǎn)主要位于球狀區(qū)，其中包含6個(gè)反向平行的β折疊，大部分抗原位點(diǎn)主要位于前400個(gè)氨基酸殘基，即β1～β3折疊上。因此，根據(jù)前3個(gè)β

4、折疊在空間上的位置，我們將編碼前400位氨基酸的基因序列分為兩段，分別連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒：pcDNA-HN1和pcDNA-HN2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核表達(dá)細(xì)胞后，能夠與抗NDV的多抗反應(yīng)，證明蛋白成功表達(dá)并具有活性。
　　 ⑵HN蛋白不同抗原表位單抗的研制。將純化好的病毒和構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒分別免疫BALB/C小鼠后，取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。用間接ELISA方法篩選陽性克隆

5、，并采用有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行亞克隆。以病毒作為免疫原，共篩得10株雜交瘤細(xì)胞系，分別為：1B5，1C5，2G7，2G8，3B5，4C11，4H6，5C2，5G8，5G9；以兩段核酸為免疫原各篩選出1株雜交瘤細(xì)胞系，分別為4H11，2E8。單抗與NDV主要蛋白的作用結(jié)果顯示：上述單抗均針對(duì)病毒的HN蛋白。單抗的研制為新城疫病毒HN蛋白抗原差異性的研究打下了基礎(chǔ)。
　　 ⑶單抗在病毒抗原差異性研究上的應(yīng)用。將本研究獲得的和實(shí)驗(yàn)室凍存的

6、共15株針對(duì)HN蛋白的雜交瘤細(xì)胞系用辣根過氧化物酶標(biāo)記后進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)，結(jié)果顯示：15株雜交瘤細(xì)胞系分屬于10個(gè)不同的抗原位點(diǎn)。選取10株代表性的單抗對(duì)實(shí)驗(yàn)室不同來源、不同時(shí)間、不同基因型的30株NDV進(jìn)行排譜實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，其中4株單抗針對(duì)的位點(diǎn)比較保守，另外6株單抗所針對(duì)的抗原位點(diǎn)在部分毒株中發(fā)生了變異。根據(jù)單抗與病毒的反應(yīng)性，可將30株病毒分為6組，每組病毒具有不同的單抗反應(yīng)譜。單抗與病毒之間的反應(yīng)差異性表明HN蛋白上的部