人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶4抑制劑高通量篩選系統(tǒng)的建立.pdf

1、人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶同工酶選擇性抑制劑有藥用潛力。酶抑制劑可來(lái)自合理設(shè)計(jì)或組合庫(kù)。現(xiàn)有高通量篩選方法能夠降低從組合庫(kù)發(fā)現(xiàn)酶抑制劑的成本而提高效率，但要求樣品純度大于80％。本實(shí)驗(yàn)室已建立堿性磷酸酶偶聯(lián)孔雀綠定磷法測(cè)定環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性方法，及基于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、磁分離靶蛋白-配體復(fù)合物高通量篩選配體混合物的方法。本項(xiàng)目建立基于微孔板高通量篩選純化環(huán)核苷酸磷酸二酯酶抑制劑的方法，并考察篩選配體混合庫(kù)所需靶蛋白固定化方法。
　　孔雀綠定

2、磷法受高濃度變性蛋白干擾，用微孔板定磷法測(cè)定 PDE活性無(wú)法離心去除變性蛋白。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終濃度小于30 mg/L蛋白對(duì)孔雀綠定磷無(wú)干擾，這就要求基于孔雀綠定磷法高通量篩選PDE抑制劑時(shí)靶酶比活性高于0.008 kU/g。全長(zhǎng)人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶4（hPDE4）和截短突變體（152aa-528aa）編碼序列分別連接到含6His-SUMO原核表達(dá)載體pReceiver-13，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；用Ni-NTA瓊脂糖柱純化。所得全長(zhǎng)人PD

3、E4比活大于0.017 kU/g而截短突變體大于0.05 kU/g，可用于微孔板基于孔雀綠定磷高通量篩選純化候選抑制劑庫(kù)。用Biotek ELX800酶標(biāo)儀測(cè)定了兩種PDE4對(duì)cAMP、罌粟堿(PAP)、rolipram的親和性，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與用光度計(jì)常規(guī)測(cè)定結(jié)果一致?？梢?jiàn)，基于微孔板和孔雀綠定磷可高通量篩選純化磷酸二酯酶抑制劑庫(kù)。
　　Rolipram是人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的經(jīng)典抑制劑；文獻(xiàn)報(bào)道苯甲酰胺類與其結(jié)構(gòu)相似化合物對(duì)豬主動(dòng)脈

4、 PDE4有很強(qiáng)抑制作用，但未報(bào)道對(duì)hPDE4是否也有強(qiáng)抑制作用。異香草醛烷基化、氧化以及和氨基化合物酰胺化，合成一系列苯甲酰胺類化合物候選抑制劑，用HPLC確認(rèn)純度都高于80%。用所建立高通量方法測(cè)定了該類化合物對(duì)全長(zhǎng)hPDE4的親和力，發(fā)現(xiàn)該類化合物對(duì)全長(zhǎng)hPDE4仍有較強(qiáng)抑制活性，但抑制劑的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系明顯不同于用豬主動(dòng)脈PDE4為靶酶。
　　用酶抑制劑混合物為庫(kù)成分篩選抑制劑要求將靶蛋白固定化在磁珠表面且保留活性。Ni2

5、+-NTA磁珠或雙砜磁珠能固定化6His融合表達(dá)靶蛋白。Ni2+-NTA磁珠易制備且固定化反應(yīng)快，但其固定化產(chǎn)物在pH8.0時(shí)穩(wěn)定而測(cè)定配體親和力適合用pH7.4，且pH值可能影響配體對(duì)靶酶親和力。在pH8.0和pH7.4時(shí)抑制劑對(duì)hPDE4親和力有明顯差異；6His標(biāo)簽融合表達(dá)大腸桿菌堿性磷酸酶與 Ni2+-NTA磁珠結(jié)合后，在pH7.4時(shí)3 h內(nèi)固定化酶解離不超過(guò)6%，適合從競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)體系回收90%以上靶蛋白-配體復(fù)合物；6His