大腸桿菌對恩諾沙星抗藥性突變規(guī)律研究.pdf

1、細(xì)菌對抗菌藥物產(chǎn)生抗藥性是獸醫(yī)臨床遇到的重要難題之一，檢測臨床分離細(xì)菌的抗藥性對及時(shí)掌握細(xì)菌的抗藥趨勢有重要作用。研究大腸桿菌對喹諾酮抗藥性突變規(guī)律，以及基因型與表型的對應(yīng)關(guān)系，可以根據(jù)臨床檢測的抗藥性表型判斷和預(yù)測相應(yīng)的基因突變。
　　 本文以藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株EscherichiacoliATCC25922為初始菌株，建立氟喹諾酮最敏感的靶位蛋白祖先基因，用恒化連續(xù)培養(yǎng)、恩諾沙星遞增濃度連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)及抗藥性基因定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，獲

2、得一系列抗藥性菌株，測定其對恩諾沙星的MIC值，并比較喹諾酮靶酶基因gyrA和parC的完整序列及其突變位點(diǎn)，分析了抗藥性表型與基因型、蛋白結(jié)構(gòu)、外排泵及生化特性的關(guān)系，以此為標(biāo)尺對比了臨床菌株的MIC。
　　 研究結(jié)果表明大腸桿菌對氟喹諾酮抗藥性突變具有明顯規(guī)律，低濃度喹諾酮并不能誘導(dǎo)高的抗藥性突變;GyrA的Ser83-Leu位點(diǎn)單一的突變，進(jìn)而增加ParC的Glu84-Lys，可導(dǎo)致低水平抗藥性;而Ser83-Leu逐步與

3、Asp87-Gly、Glu84-Lys組合，導(dǎo)致喹諾酮突變決定區(qū)突變位點(diǎn)氨基酸的極性、空間位阻變化影響靶蛋白與DNA和恩諾沙星的結(jié)合，造成4個(gè)明顯的敏感性平臺:0.125、0.5、2、8μg·mL-1，其中0.5μg·mL-1對應(yīng)MIC=2μg·mL-1，即CLSI推薦的R值2μg·mL-1，當(dāng)突變位點(diǎn)包含Ser83-Leu，Asp87-Gly和Glu84-Lys，而高于R值的菌株生化特性也發(fā)生了顯著的改變，菌落黏度變大。
　　

4、 利用定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)技術(shù)依次將gyrA亞基中易突變位點(diǎn)83、81、84、87構(gòu)建在同一個(gè)重組質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC25922，結(jié)果當(dāng)構(gòu)建在表達(dá)載體菌株中突變位點(diǎn)依次增加時(shí)，對恩諾沙星的MIC累積提高。當(dāng)將gyrA亞基易突變位點(diǎn)81、83、84、87最終構(gòu)建在同一重組質(zhì)粒表達(dá)載體中，最終的MIC值為64μg·mL-1，結(jié)果和遞增濃度喹諾酮分步誘導(dǎo)大腸桿菌實(shí)驗(yàn)最高M(jìn)IC值相近。通過基因型與表型的對應(yīng)關(guān)系，判斷1485株臨床大腸桿菌分

5、離頻率最高的MIC=8-16μg·mL-1，其基因型仍然是Ser83-Leu、Asp87-Gly、Glu84-Lys，而MIC高于32μg·mL-1，外排泵與基因突變共同作用，使細(xì)菌耐受逐步升高的藥物濃度，MIC基本平行地高出培養(yǎng)濃度的1倍。綜合分析本研究所獲得試驗(yàn)結(jié)果，表明增加恩諾沙星的使用劑量，能誘導(dǎo)高抗菌株產(chǎn)生，恩諾沙星抗藥性表型與基因型具有對應(yīng)關(guān)系和規(guī)律性變化，據(jù)此可以通過臨床菌株的MIC判斷抗藥性突變基因型，預(yù)測下一步可能的突