湖北海棠MhRar1、MhSgt1基因轉(zhuǎn)化蘋果提高輪紋病抗性的研究.pdf

1、RAR1和SGT1是植物抗性(resistance，R)基因介導(dǎo)的抗病防衛(wèi)途徑中的兩個重要信號元件，在R蛋白下游和活性氧產(chǎn)生之間發(fā)揮作用。為探索Rar1和Sgt1類基因在異源植物體內(nèi)的表達特性及其在植物抗病反應(yīng)方面的功能，開展了本研究。
　　 本文研究了rDNA-ITS序列在蘋果輪紋病病原菌分類鑒定中的作用，以及該序列的變異情況與菌落生物學(xué)特性、致病能力間的聯(lián)系，篩選了離體條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生蘋果輪紋病分生孢子的有效途徑，為轉(zhuǎn)基因植株

2、抗病性檢測提供了材料。
　　 在實驗室原有轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將從抗病性較強的湖北海棠(Malus hupehensis)中克隆的MhRar1基因和MhSgt1基因，分別轉(zhuǎn)入模式植物煙草(Nicotiana tabacum)和感病蘋果品種長富6號(Nagafuji No.6)。并通過煙草灰霉病病原菌(Botrytis cinerea Pevs.)和蘋果輪紋病病原菌[Botryosphaeria berengeri

3、ana de Not f.sp.Piricola(Nose)]，對轉(zhuǎn)基因植株進行侵染，以驗證兩種基因在煙草和蘋果抗病反應(yīng)中的作用。研究結(jié)果如下:
　　 1.以來自不同地區(qū)的10個蘋果輪紋病菌株為研究對象，采用通用引物ITS1和ITS4對rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增和克隆測序，通過序列比對發(fā)現(xiàn)有5個菌株在ITS1區(qū)序列上存在變異的堿基。通過同源性比較和生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)10個菌株均屬于輪紋病病原菌第Ⅰ亞類。

4、檢測了變異菌株菌落的生長速度、產(chǎn)孢能力和致病效果與普通菌株的差異。發(fā)現(xiàn)堿基變異程度較大的菌株，其菌絲生長速度、產(chǎn)孢能力和侵染效果，都要優(yōu)于變異較少或未發(fā)生變異的菌株。同時研究了培養(yǎng)基種類、pH、培養(yǎng)溫度、光源和光照條件對菌絲體生長和分生孢子發(fā)生的影響以及刮除菌絲體對分生孢子發(fā)生的影響。綜合比較后確定輪紋病菌落生長的適宜條件為25-30℃、pH5.0-7.0的馬鈴薯培養(yǎng)基，接種后在黑光燈和日光燈下交替培養(yǎng)有利于分生孢子囊和分生孢子的快速產(chǎn)

5、生;菌絲體生長到一定程度后，刮除菌絲體對產(chǎn)生大量分生孢子有顯著促進作用。
　　 2.用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將上述兩種基因分別轉(zhuǎn)入煙草，抗性苗誘導(dǎo)率為61.02％和55.58％。對Hyg陽性株系依次進行PCR和RT-PCR檢測，最終篩選出11個轉(zhuǎn)MhRar1煙草株系和8個轉(zhuǎn)MhSgt1株系。通過對接種病菌后離體葉片和植株進行抗病性鑒定和抗氧化酶(SOD\ POD\ CAT)活性檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化兩種基因的煙草的離體葉片可以表現(xiàn)出對灰霉病的抗性

6、，而且被侵染后轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)三種抗氧化酶活性和MDA含量的指標都高于對照。轉(zhuǎn)化兩種基因的煙草植株經(jīng)自交結(jié)實產(chǎn)生的T1代種子同樣表現(xiàn)出Hyg抗性，且幼苗在灰霉病侵染下生長良好，初步說明轉(zhuǎn)基因特性能夠穩(wěn)定遺傳，而且兩種基因的轉(zhuǎn)化具有一定的提高植株抗真菌病害的能力。
　　 3.根據(jù)實驗室已有的再生和轉(zhuǎn)化體系，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將MhRar1和MhSgt1基因分別轉(zhuǎn)入富士蘋果，轉(zhuǎn)化率為2.47％和1.53％。對Hyg陽性植株依次進行PCR