輪紋病致病菌Botryosphaeria dothidea侵染對(duì)蘋果抗性反應(yīng)、乙烯合成和相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、蘋果輪紋病是我國(guó)蘋果產(chǎn)區(qū)的主要病害，屬于真菌性病害，主要危害枝干和果實(shí)，為果品生產(chǎn)造成重大威脅。因此研究蘋果果實(shí)與輪紋病菌之間的關(guān)系具有重要意義。我們通過(guò)研究和解析蘋果抗病及免疫機(jī)理，分析蘋果在受到病菌侵染后的各種生理活動(dòng)和脅迫應(yīng)答來(lái)挖掘蘋果抗病基因和了解蘋果抗病機(jī)制。蘋果抗病基因的挖掘是進(jìn)行品種改良的基礎(chǔ)，對(duì)于培育抗病品種以及高效生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蘋果具有重要的意義，同時(shí)該研究也對(duì)深入了解蘋果的抗病基因具有重要的意義。為蘋果優(yōu)新抗病種質(zhì)資源的培

2、育提供科技支撐和依據(jù)，服務(wù)我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
　　本實(shí)驗(yàn)以‘富士’和‘金冠’兩種質(zhì)地不同的蘋果果實(shí)為材料，通過(guò)對(duì)蘋果接種輪紋病菌后，測(cè)定果實(shí)乙烯釋放量、硬度、基因相對(duì)表達(dá)量來(lái)進(jìn)行蘋果抗病性的系統(tǒng)研究，并對(duì)乙烯合成相關(guān)基因、細(xì)胞壁軟化基因和PR家族基因進(jìn)行深入研究。結(jié)果表明相關(guān)基因被病菌大量誘導(dǎo)表達(dá)，兩個(gè)品種在抗蘋果輪紋病方面存在顯著差異，且蘋果在不同發(fā)育時(shí)期的抗病反應(yīng)非常復(fù)雜。針對(duì)病程相關(guān)基因在蘋果抗病中的表達(dá)，我們從蘋果中篩選出

3、MdPR5和MdPR8，通過(guò)植物RNA的提取、PCR技術(shù)和基因克隆等方法，獲得蘋果中基因的cDNA序列，并對(duì)之進(jìn)行了序列對(duì)比分析、基因表達(dá)和轉(zhuǎn)基因分析，通過(guò)分子生物學(xué)手段驗(yàn)證不同種類蘋果中抗病基因的表達(dá)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.植物體在逆境脅迫下的活性氧積累情況。以‘嘎拉’組培苗為試材，對(duì)葉片和植物接種輪紋病菌和flg22處理后，用DAB染色法檢測(cè)活性氧的產(chǎn)生情況。結(jié)果葉片在受到輪紋病菌和flg22處理后有明顯的黃色沉淀顆粒，

4、黃色顆粒越多說(shuō)明活性氧產(chǎn)生的越多，植株在受到flg22處理后莖部發(fā)紅，說(shuō)明葉片和植株都發(fā)生了逆境響應(yīng)。
　　2.輪紋病菌接種富士和金冠兩個(gè)品種的蘋果果實(shí)，在幼果期、膨大期、成熟期三個(gè)發(fā)育時(shí)期的乙烯釋放速率、硬度變化、病斑大小差異明顯，且用1-MCP處理接菌的果實(shí)，抑制乙烯釋放的效果在不同品種的不同時(shí)期也不同，以金冠成熟期的變化最顯著，接菌后金冠果實(shí)的病斑和硬度都明顯小于富士的。對(duì)乙烯合成相關(guān)基因 MdERF2、MdACS4、MdC

5、TR1、MdACS5a、MdACS5b進(jìn)行 qRT-PCR分析，結(jié)果表明在成熟期， MdACS5a、MdACS5b這兩個(gè)基因在輪紋病菌誘導(dǎo)下表達(dá)量明顯升高。研究1-MCP對(duì)基因表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)1-MCP對(duì)MdACS5a、MdACS5b表達(dá)量的升高有顯著抑制作用，1-MCP對(duì)MdACS4表達(dá)的抑制作用作用在金冠成熟期第六天較明顯。
　　3.接菌的富士和金冠兩種蘋果果實(shí)，在不同發(fā)育時(shí)期對(duì)細(xì)胞壁軟化基因AFS1、PG1和PRs中的Md

6、PR5、MdPR8、MdPR4進(jìn)行qRT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)接菌后幼果期和膨大期細(xì)胞壁軟化基因相對(duì)表達(dá)量有明顯升高。PRs相關(guān)基因的表達(dá)量在病菌侵染下也明顯增高，這表明PRs具有抗病性。
　　4.克隆MdPR5和MdPR8兩個(gè)病程相關(guān)基因，進(jìn)行序列分析和表達(dá)分析，并進(jìn)行原核誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析。為蘋果抗病基因的挖掘和蘋果品種改良做出基礎(chǔ)性工作。并通過(guò)氨基酸序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)MdPR5的氨基酸序列與蘋果、擬南芥、梨、榅桲的某些序列