蘋果MdWRKY33基因在輪紋病抗性形成中的作用機(jī)制研究.pdf

1、蘋果輪紋病是制約我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害之一，由致病真菌Botryosphaeriadothidea引起。該病菌不僅能夠侵染枝干，導(dǎo)致樹體衰弱，還能侵染果實(shí)，形成同心輪紋病斑致果實(shí)腐爛;同時(shí)由于該病菌的潛伏特性，使蘋果輪紋病成為果實(shí)貯運(yùn)期的重要病害之一，致使蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)急劇下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　植物在與病原菌漫長的協(xié)同進(jìn)化過程中形成了極為復(fù)雜的抗病與免疫反應(yīng)機(jī)制，使其能夠針對特定病原菌的入侵而相應(yīng)地激發(fā)植物抗病反應(yīng)。

2、經(jīng)典的植物病理學(xué)研究表明:植物抗?fàn)I活體寄生菌主要依賴于水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而抗?fàn)I腐體寄生菌主要依賴于茉莉酸/乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。輪紋病菌屬于兼性寄生菌，目前對該病菌與蘋果互作的分子機(jī)制研究以及該病菌入侵后引起的抗病反應(yīng)的研究，報(bào)道較少。因此，開展輪紋病菌與蘋果果實(shí)互作的分子機(jī)制研究，對蘋果抗病基因的挖掘、輪紋病菌防治機(jī)理的豐富和抗輪紋病新品種的培育均具有重要意義。
　　本文以易感品種‘富士’果實(shí)為試材，首先研究了輪紋病菌B.doth

3、idea在蘋果果實(shí)中的擴(kuò)展方式以及對蘋果果實(shí)細(xì)胞的傷害;其次研究了乙烯信號分子在蘋果果實(shí)發(fā)病中的作用，發(fā)現(xiàn)了乙烯在蘋果果實(shí)與輪紋病菌互作中作為致病因子，促進(jìn)果實(shí)發(fā)病;此外還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY33參與調(diào)控了蘋果病程相關(guān)基因MdPRs的表達(dá)，并且介導(dǎo)了乙烯的致毒作用。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.運(yùn)用半薄切片與掃描電鏡技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，B.dothidea侵入果實(shí)細(xì)胞后，菌絲大量存在于植物細(xì)胞壁與細(xì)胞間隙中。細(xì)胞壁降解為受

4、B.dothidea侵染的蘋果果實(shí)細(xì)胞的典型受害癥狀;部分受害細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離;核染色質(zhì)濃縮并聚集于核膜上，呈典型細(xì)胞凋亡癥狀。
　　2.乙烯在輪紋病發(fā)病過程中作為致毒因子促進(jìn)蘋果果實(shí)發(fā)病。對不同成熟度與生理狀態(tài)的三批果實(shí)，即‘富士’幼果、新鮮成熟果實(shí)與儲(chǔ)藏果實(shí)，接種輪紋病菌后，施用乙烯抑制劑1-MCP，能夠顯著抑制果實(shí)發(fā)病;1-MCP對病斑的抑制作用呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性，1-MCP濃度越高，抑制作用越明顯;相同濃度1-MCP對成

5、熟果實(shí)病斑擴(kuò)展的抑制效果最好;用外源乙烯預(yù)處理能夠促進(jìn)果實(shí)病斑擴(kuò)展。
　　3.在乙烯抑制劑1-MCP處理下，蘋果病程相關(guān)基因MdPRs的表達(dá)進(jìn)一步升高。B.dothidea能夠誘導(dǎo)‘富士’幼果和新鮮成熟果中MdPR-5、MdPR-8和MdPR-4基因的表達(dá)，當(dāng)用1-MCP處理接菌果實(shí)，病菌侵染誘導(dǎo)的MdPRs基因的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng);而在儲(chǔ)藏成熟果實(shí)中，輪紋病菌侵染卻抑制了MdPRs基因的表達(dá)，1-MCP處理能夠完全逆轉(zhuǎn)輪紋病菌對Md

6、PRs基因的抑制作用。此外，編碼幾丁質(zhì)酶的MdChiB-1基因在幼果中不被輪紋病菌誘導(dǎo)，用1-MCP處理之后，其表達(dá)在輪紋病菌侵染下顯著升高;新鮮成熟果實(shí)在1-MCP處理下，該基因的表達(dá)在輪紋病菌侵染下也進(jìn)一步增強(qiáng);而在儲(chǔ)藏果實(shí)中，輪紋病菌對該基因的抑制作用被去除。因此，在1-MCP處理下，蘋果病程相關(guān)基因MdPRs表達(dá)水平進(jìn)一步升高，可能是增強(qiáng)蘋果抗病能力，限制病斑擴(kuò)展的重要因素。
　　4.蘋果轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY33-1(MD

7、P0000296025)的表達(dá)與病程相關(guān)基因MdPRs的表達(dá)高度協(xié)同。通過對19個(gè)轉(zhuǎn)錄因子做RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，B.dothidea只能誘導(dǎo)幼果中乙烯信號轉(zhuǎn)錄因子MdERF2的表達(dá)并且對幼果中MdERF3、MdERF98-3、MdERF98-6和MdERF98-7的誘導(dǎo)作用比對成熟果顯著，1-MCP處理能抑制B.dothidea對ERFs的誘導(dǎo)表達(dá);只有轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY33-1的表達(dá)在接菌果實(shí)的乙烯合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被抑制時(shí)，表達(dá)

8、進(jìn)一步升高，與MdPRs表達(dá)變化高度協(xié)同——在幼果中變化不大，在成熟果中表達(dá)量進(jìn)一步升高，在儲(chǔ)藏果中的表達(dá)抑制被解除;在各種激素和過氧化物等非生物脅迫下，‘嘎啦’組培苗中的MdWRKY33-1與MdChiB-1、MdPR-5、MdPR-8、MdPR-4這些MdPRs的表達(dá)變化也表現(xiàn)出了高度協(xié)同。
　　5.MdWRKY33-1過表達(dá)能提高病程相關(guān)蛋白基因MdPRs的表達(dá)。轉(zhuǎn)化蘋果原生質(zhì)體過表達(dá)ERFs和MdWRKY33轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)

9、只有MdWRKY33-1能明顯提高M(jìn)dPRs的表達(dá)，說明MdWRKY33-1對MdPRs的表達(dá)起調(diào)控作用。
　　6.在蘋果果實(shí)中，輪紋病菌所誘導(dǎo)的乙烯合成途徑與果實(shí)成熟過程中的乙烯合成途徑不同。B.dothidea誘導(dǎo)的乙烯合成是通過影響MdACS5a，MdACS5b的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，與蘋果果實(shí)成熟過程中乙烯的合成途徑不同（MdAS1，MdACS3）。通過RT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，負(fù)責(zé)介導(dǎo)由傷害脅迫引發(fā)的植物乙烯合成中的MdACS5a

10、和MdACS5b基因的表達(dá)，能被輪紋病菌顯著誘導(dǎo)，但輪紋病菌不能誘導(dǎo)負(fù)責(zé)果實(shí)成熟過程中乙烯合成與躍變的MdACS1和MdACS3的表達(dá)，說明B.dothidea誘導(dǎo)的果實(shí)乙烯合成與蘋果果實(shí)成熟過程中的乙烯合成不同。乙烯受體基因MdERS1、MdERS2只在幼果中被B.dothidea誘導(dǎo)，在成熟果實(shí)中不被誘導(dǎo)，1-MCP處理能夠抑制B.dothidea對它們的誘導(dǎo)作用;類似地，輪紋病菌對幼果乙烯受體基因MdETR2、乙烯轉(zhuǎn)錄因子MdER