松材線蟲運動行為及其神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的相關研究.pdf

1、松材線蟲病，又稱松枯萎病，是世界上最具危險性的林木病害，其病原松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是重要的檢疫性有害生物。目前該病在日本、韓國、美國和中國等地都有分布，但危害程度不一。
　　 松材線蟲是一種遷移性線蟲，其寄生與致病特征與其運動行為密切相關，而運動行為是受神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控的。本研究圍繞松材線蟲的運動行為及神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，開展了一系列工作。
　　 本研究首先對來自山東威海黑松、浙江寧

2、波馬尾松、浙江杭州馬尾松以及陜西柞水油松的松材線蟲進行了鑒定，保存為BXRC1、NXY61、NXY67和BXZS株系。測定了在PDA－灰葡萄孢上培養(yǎng)時的繁殖力，以及在黑松等寄主樹種枝條內(nèi)的遷移力特征。結(jié)果證明，三個蟲株的繁殖能力依次為NXY61、NXY67和BXRC1。在黑松、赤松和華山松枝條中BXRC1的遷移力是最強的，在油松枝條中NXY67的遷移力是最強的，而在白皮松和雪松枝條中三個蟲株的遷移力都相對較弱。
　　 基于乙酰膽

3、堿作為神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)生物學特征，本文研究了抗膽堿藥和抗膽堿酯酶藥對松材線蟲自由運動行為的影響。通過顯微鏡觀察用抗膽堿藥硫酸阿托品(Atropine sulfate)處理的松材線蟲自由運動行為的變化，發(fā)現(xiàn)松材線蟲幼蟲和成蟲行為的異常，一般表現(xiàn)為活動的減慢，包括頭部擺動頻率和身體彎曲頻率的減小，身體的不正常扭動，多呈螺旋狀卷曲或多節(jié)卷曲，而正常松材線蟲在液體中的扭動會呈大的S形。觀察抗膽堿酯酶藥甲硫酸新斯的明(Neostigmine met

4、ilsulfate)對松材線蟲自由運動行為的影響，發(fā)現(xiàn)甲硫酸新斯的明對松材線蟲的頭部擺動頻率和身體彎曲頻率并無明顯的影響，但可看到線蟲擺動幅度的增大，擺動速度的加快等特點，所以線蟲總體消耗的能量是增大的，這符合抗膽堿酯酶藥物對于神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。
　　 此外，還克隆了BXRC1松材線蟲株系的神經(jīng)系統(tǒng)相關基因乙酰膽堿酯酶基因ace－1，經(jīng)分析該基因包含1869bp完整的ORF序列，包括起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，編碼了62

5、2個氨基酸，預測的蛋白質(zhì)分子量為71.231kDa，等電點為5.56。利用GenBank中的BLAST與其他松材線蟲及其他物種的ace－1序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該基因同GenBank中登錄號為GU166345的ace－1序列相似度為99.89％，推導的蛋白質(zhì)序列同相似度為99.84％，與來自胎生網(wǎng)尾線蟲(Dictyocaulus viviparus)，秀麗隱桿線蟲(Caenorthadits elegans)等物種的類似序列的相似度為57.

6、06％到99.89％。采用MEGA4.1neighbor－joining(NJ)法構建氨基酸系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明：BXRC1蟲株與GenBank上登錄號為GU166345的ace－1序列所屬的蟲株遺傳距離非常近，為同一種，同為松材線蟲。BXRC1蟲株乙酰膽堿酯酶與甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)和爪畦根結(jié)線蟲(M.javanica)的乙酰膽堿酯酶屬于同