蝦夷扇貝大防御素基因的克隆、表達(dá)及G-型溶菌酶基因的啟動(dòng)子分析.pdf

1、蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)是在大連沿海的主要增養(yǎng)殖貝類。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大以及養(yǎng)殖環(huán)境的變化，蝦夷扇貝養(yǎng)殖出現(xiàn)了嚴(yán)重的病害和死亡現(xiàn)象，因此，研究和探索蝦夷扇貝死亡的原因及其防治十分必要。本研究是以兩種重要的免疫相關(guān)基因一大防御素和G型溶菌酶基因作為研究對(duì)象，通過分子生物學(xué)手段，克隆分析大防御素基因，通過菌刺激實(shí)驗(yàn)，利用實(shí)時(shí)定量方法了解該基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律；通過獲得G型溶菌酶基因的啟動(dòng)子序列，并對(duì)其

2、進(jìn)行分析，了解其轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　 本研究采用基因克隆的方法，從蝦夷扇貝外套膜cDNA文庫中克隆得到蝦夷扇貝大防御素(MyBD)全長(zhǎng)cDNA序列(基因登錄號(hào)：GH736001)。MyBD的cDNA全長(zhǎng)為720bp，通過生物學(xué)軟件分析cDNA結(jié)構(gòu)，5’非編碼區(qū)(UTR)為29 bp，開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)384 bp，編碼127個(gè)氨基酸殘基，3’UTR長(zhǎng)度為307bp，包含一個(gè)公認(rèn)的多腺苷

3、酸化信號(hào)序列AATAAA和一個(gè)poly(A)尾巴。預(yù)測(cè)得到的MyBD氨基酸序列具有大防御素的一般特征，包括二硫鍵和功能結(jié)構(gòu)域，這說明MyBD是大防御素家族的一員。利用QRT-PCR(quantitative real time PCR)分析MyBD mRNA在不同組織中的表達(dá)，以及鰻弧桿菌(Vibrillo anguillarum)感染后在蝦夷扇貝血淋巴中各時(shí)間段的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MyBD在成體扇貝的外套膜組織中表達(dá)量最高，菌刺激3

4、6小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的表達(dá)量差異達(dá)到最大。因此推論可知，MyBD可能是蝦夷扇貝中一種重要的免疫相關(guān)基因，在蝦夷扇貝的成體組織中起著重要作用。為分析基因結(jié)構(gòu)，通過擴(kuò)增測(cè)序得到了3段內(nèi)含子序列，編碼區(qū)兩段內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為2664bp，2176bp，內(nèi)含子兩側(cè)都具有RNA正確剪接所必需的識(shí)別位點(diǎn)(GT/AG)，另一段內(nèi)含子通過基因步移得到，位于5’UTR，長(zhǎng)度尚未確定，這3段內(nèi)含子將已知序列分成4部分。
　　 溶菌酶是免疫系統(tǒng)中的重

5、要免疫效應(yīng)物之一，能通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁殺死細(xì)菌。根據(jù)蝦夷扇貝G型溶菌酶基因的已知序列設(shè)計(jì)引物，通過基因步移的方法擴(kuò)增出MyLysoG的5’端側(cè)翼序列，測(cè)序所得長(zhǎng)度為978 bp。TRANSFAC軟件對(duì)MyLysoG的5’端側(cè)翼序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因的啟動(dòng)子區(qū)除了具有 TATAbox外，還具備Oct-1、S8、C/EBP、CdxA等與免疫基因激活的轉(zhuǎn)錄因子潛在的結(jié)合位點(diǎn)。通過比對(duì)15個(gè)扇貝的MyLysoG啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)了9個(gè)SNP位點(diǎn)和