豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法及疫苗中牛病毒性腹瀉毒檢測(cè)方法的研究.pdf

1、豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的豬的高度致死性、接觸性傳染病，是OIE規(guī)定的必須通報(bào)的A類(lèi)動(dòng)物傳染病之一。豬瘟兔化弱毒(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)是世界公認(rèn)的最安全、免疫效果最好的豬瘟疫苗毒株，也是我國(guó)唯一使用的豬瘟疫苗毒株。CSFV只感染豬。HCLV只引起家兔發(fā)生熱反應(yīng)，在敏感的細(xì)胞培

2、養(yǎng)物生長(zhǎng)繁殖后，無(wú)CPE出現(xiàn)。家兔熱反應(yīng)是HCLV病毒效價(jià)測(cè)定和CSF疫苗成品效力檢驗(yàn)的主要方法。HCLV所致的家兔熱反應(yīng)存在個(gè)體差異大和測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)(3-9天)等問(wèn)題。此外，現(xiàn)有熒光抗體技術(shù)不適用于成品和半成品中的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)污染的檢測(cè)。據(jù)報(bào)道，豬瘟疫苗中污染BVDV后，HCLV有效免疫原量減少，致使臨床使用后發(fā)生豬瘟免疫失敗。同時(shí)，BVDV可引起豬只發(fā)生類(lèi)似豬瘟的

3、疫病，導(dǎo)致疫苗接種豬發(fā)病或死亡。因此，研究可替代兔熱法的HCLV效價(jià)測(cè)定和效力檢驗(yàn)方法，以及能夠用于豬瘟疫苗生產(chǎn)中半成品和成品BVDV污染檢測(cè)的新技術(shù)具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。
　　 本文報(bào)道用于HCLV的效價(jià)和效力檢測(cè)的熒光定量PCR(Real time FluorogeneticQuantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)、WH303單抗熒光TCID50(McAb-FITCID50)及檢測(cè)豬瘟疫苗中BVDV污染的FQ-

4、PCR試劑盒的研制結(jié)果。
　　 1、HCLV FQ-PCR和BVDV FQ-PCR根據(jù)GenBank公布的CSFV全序列、BVDV全序列和綿羊邊界病病毒(Border Disease Virus，BDV)全序列綜合比對(duì)分析結(jié)果，分別設(shè)計(jì)針對(duì)HCLV和BVDV的特異性TaqMan-MGB熒光探針和引物，構(gòu)建陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，建立起HCLV和BVDV的特異的絕對(duì)定量FQ-PCR試劑盒。結(jié)果顯示，HCLV FQ-PCR檢測(cè)靈敏度為4.35個(gè)

5、核酸拷貝量，CT值與模板之間相關(guān)系數(shù)為0.9998，擴(kuò)增效率為101.14％，40個(gè)質(zhì)控樣本保存6個(gè)月，CT值變異系數(shù)為1.1～4.0％；BVDV FQ-PCR方法CT值與模板之間相關(guān)系數(shù)為0.9978，擴(kuò)增效率為95.68％，20個(gè)質(zhì)控樣本保存6個(gè)月，CT值變異系數(shù)為1.1～2.4％。對(duì)CSFV、BVDV、BDV、PRRSV、FMDV等9種豬病相關(guān)病原的檢測(cè)結(jié)果顯示，HCLV FQ-PCR和BVDV FQ-PCR試劑盒均只能在HCLV

6、或BVDV樣品出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)果表明，HCLVFQ-PCR和BVDV FQ-PCR試劑盒均具有高度特異性、敏感性和穩(wěn)定性。
　　 2、McAb-FITCID50法CSFV單抗WH303雜交瘤細(xì)胞來(lái)自英國(guó)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室(VeterinaryLaboratories Agency，VLA)。采用FITC標(biāo)記WH303 McAb，對(duì)細(xì)胞接種HCLV后進(jìn)行原位直接免疫熒光檢測(cè)，可測(cè)定HCLV TCID50，從而實(shí)現(xiàn)病毒含量的定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)

7、果顯示，McAb-FITCID50法特異性好，與BVDV、BDV、PRRSV、FMDV等9種病毒無(wú)交叉反應(yīng)。
　　 3、豬瘟疫苗半成品效價(jià)應(yīng)用檢測(cè)來(lái)自4個(gè)廠家17個(gè)批次的34份豬瘟兔化弱毒疫苗半成品稀釋100萬(wàn)倍后，同時(shí)采用兔熱反應(yīng)、HCLV FQ-PCR和McAb-FITCID50測(cè)定，結(jié)果是，兩只兔子均無(wú)熱反應(yīng)(不合格)樣品共11份，F(xiàn)Q-PCR CT值為21.15～27.30，對(duì)應(yīng)病毒核酸量為8.80×102copy/μL

8、～6.52×104copy/μL，McAb-FITCID50值為10-0.6/0.1mL～10-2.5/0.1mL；兩只兔子呈現(xiàn)一只定性熱一只無(wú)熱反應(yīng)，或者一只呈現(xiàn)輕熱反應(yīng)一只無(wú)熱反應(yīng)，或者兩只都呈現(xiàn)輕熱反應(yīng)(可疑)樣品共12份，cT值為17.47～23.70，病毒含量為1.10×104copy/μL～8.55×105copy/μL，McAb-FITCID50值為10-2.4/0.1mL～10-3.76/0.1mL；兩只兔子都呈現(xiàn)定型熱

9、或者一只呈現(xiàn)定型熱一只呈現(xiàn)輕熱反應(yīng)(合格品)樣品共11份，CT值為17.10～20.80，病毒含量為8.27×104copy/μL～1.11×106copy/μL，McAb-FITCID50值為10-2.88/0.1mL～10-4.54/0.1mL。結(jié)果顯示，HCLV FQ-PCR和McAb-FITCID50測(cè)定結(jié)果與家兔熱反應(yīng)測(cè)定結(jié)果存在良好的相關(guān)性，可以用于豬瘟疫苗半成品中HCLV效價(jià)檢測(cè)。
　　 4、豬瘟疫苗半成品及成品中