豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法及疫苗中牛病毒性腹瀉毒檢測方法的研究.pdf

1、豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的豬的高度致死性、接觸性傳染病，是OIE規(guī)定的必須通報的A類動物傳染病之一。豬瘟兔化弱毒(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)是世界公認的最安全、免疫效果最好的豬瘟疫苗毒株，也是我國唯一使用的豬瘟疫苗毒株。CSFV只感染豬。HCLV只引起家兔發(fā)生熱反應，在敏感的細胞培

2、養(yǎng)物生長繁殖后，無CPE出現(xiàn)。家兔熱反應是HCLV病毒效價測定和CSF疫苗成品效力檢驗的主要方法。HCLV所致的家兔熱反應存在個體差異大和測定時間長(3-9天)等問題。此外，現(xiàn)有熒光抗體技術不適用于成品和半成品中的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)污染的檢測。據(jù)報道，豬瘟疫苗中污染BVDV后，HCLV有效免疫原量減少，致使臨床使用后發(fā)生豬瘟免疫失敗。同時，BVDV可引起豬只發(fā)生類似豬瘟的

3、疫病，導致疫苗接種豬發(fā)病或死亡。因此，研究可替代兔熱法的HCLV效價測定和效力檢驗方法，以及能夠用于豬瘟疫苗生產(chǎn)中半成品和成品BVDV污染檢測的新技術具有重大經(jīng)濟價值和社會意義。
　　 本文報道用于HCLV的效價和效力檢測的熒光定量PCR(Real time FluorogeneticQuantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)、WH303單抗熒光TCID50(McAb-FITCID50)及檢測豬瘟疫苗中BVDV污染的FQ-

4、PCR試劑盒的研制結果。
　　 1、HCLV FQ-PCR和BVDV FQ-PCR根據(jù)GenBank公布的CSFV全序列、BVDV全序列和綿羊邊界病病毒(Border Disease Virus，BDV)全序列綜合比對分析結果，分別設計針對HCLV和BVDV的特異性TaqMan-MGB熒光探針和引物，構建陽性標準品，建立起HCLV和BVDV的特異的絕對定量FQ-PCR試劑盒。結果顯示，HCLV FQ-PCR檢測靈敏度為4.35個

5、核酸拷貝量，CT值與模板之間相關系數(shù)為0.9998，擴增效率為101.14％，40個質控樣本保存6個月，CT值變異系數(shù)為1.1～4.0％；BVDV FQ-PCR方法CT值與模板之間相關系數(shù)為0.9978，擴增效率為95.68％，20個質控樣本保存6個月，CT值變異系數(shù)為1.1～2.4％。對CSFV、BVDV、BDV、PRRSV、FMDV等9種豬病相關病原的檢測結果顯示，HCLV FQ-PCR和BVDV FQ-PCR試劑盒均只能在HCLV

6、或BVDV樣品出現(xiàn)陽性反應。結果表明，HCLVFQ-PCR和BVDV FQ-PCR試劑盒均具有高度特異性、敏感性和穩(wěn)定性。
　　 2、McAb-FITCID50法CSFV單抗WH303雜交瘤細胞來自英國獸醫(yī)實驗室(VeterinaryLaboratories Agency，VLA)。采用FITC標記WH303 McAb，對細胞接種HCLV后進行原位直接免疫熒光檢測，可測定HCLV TCID50，從而實現(xiàn)病毒含量的定量檢測。實驗結

7、果顯示，McAb-FITCID50法特異性好，與BVDV、BDV、PRRSV、FMDV等9種病毒無交叉反應。
　　 3、豬瘟疫苗半成品效價應用檢測來自4個廠家17個批次的34份豬瘟兔化弱毒疫苗半成品稀釋100萬倍后，同時采用兔熱反應、HCLV FQ-PCR和McAb-FITCID50測定，結果是，兩只兔子均無熱反應(不合格)樣品共11份，F(xiàn)Q-PCR CT值為21.15～27.30，對應病毒核酸量為8.80×102copy/μL

8、～6.52×104copy/μL，McAb-FITCID50值為10-0.6/0.1mL～10-2.5/0.1mL；兩只兔子呈現(xiàn)一只定性熱一只無熱反應，或者一只呈現(xiàn)輕熱反應一只無熱反應，或者兩只都呈現(xiàn)輕熱反應(可疑)樣品共12份，cT值為17.47～23.70，病毒含量為1.10×104copy/μL～8.55×105copy/μL，McAb-FITCID50值為10-2.4/0.1mL～10-3.76/0.1mL；兩只兔子都呈現(xiàn)定型熱

9、或者一只呈現(xiàn)定型熱一只呈現(xiàn)輕熱反應(合格品)樣品共11份，CT值為17.10～20.80，病毒含量為8.27×104copy/μL～1.11×106copy/μL，McAb-FITCID50值為10-2.88/0.1mL～10-4.54/0.1mL。結果顯示，HCLV FQ-PCR和McAb-FITCID50測定結果與家兔熱反應測定結果存在良好的相關性，可以用于豬瘟疫苗半成品中HCLV效價檢測。
　　 4、豬瘟疫苗半成品及成品中