豬瘟兔化弱毒疫苗株細(xì)胞毒E2基因的克隆與序列分析.pdf

1、本論文對(duì)豬瘟兔化弱毒疫苗株在豬睪丸(ST)細(xì)胞和牛睪丸(BT)細(xì)胞上培養(yǎng)適應(yīng)性、病毒增殖能力及細(xì)胞的純凈性方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究；從分子水平的角度，分析和比較了豬瘟兔化弱毒疫苗株ST細(xì)胞和BT細(xì)胞毒的主要保護(hù)性抗原E2蛋自在抗原編碼區(qū)內(nèi)氨基酸的變異情況，同時(shí)對(duì)其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并應(yīng)用遺傳進(jìn)化樹(shù)理論對(duì)其E2基因的來(lái)源及其分子遺傳衍化規(guī)律進(jìn)行研究。 本實(shí)驗(yàn)所用的豬瘟兔化弱毒疫苗株分別在ST細(xì)胞和BT細(xì)胞上培養(yǎng)

2、增殖后，從病毒感染的細(xì)胞液中直接提取核酸。應(yīng)用Oligo(6.0版本)引物設(shè)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)豬瘟病毒(CSFV)E2基因片段的特異性PCR引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法擴(kuò)增兩種豬瘟兔化弱毒疫苗株細(xì)胞(ST、BT)毒E2基因的cDNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)分離純化后克隆到pMD 18-T載體中，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定純化后進(jìn)行序列測(cè)定，然后應(yīng)用DNAstar軟件進(jìn)行序列的拼接、序列信息編輯和分析。同時(shí)從GenBank中

3、下載了豬瘟兔化弱毒疫苗株P(guān)K15細(xì)胞毒株、石門(mén)強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)株以及豬瘟標(biāo)準(zhǔn)C-株的E2基因序列，分析了豬瘟兔化弱毒疫苗株ST、BT細(xì)胞毒E2基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性和差異性，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，以闡明豬瘟兔化弱毒疫苗株在適應(yīng)了ST細(xì)胞和BT細(xì)胞后，ST、BT細(xì)胞毒主要保護(hù)性抗原的變異情況及其遺傳演化規(guī)律。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬瘟兔化弱毒疫苗株經(jīng)ST細(xì)胞和BT細(xì)胞培養(yǎng)增殖后，豬瘟兔化弱毒疫苗株不僅在BT細(xì)胞上具有良好的適應(yīng)性，

4、而且在ST傳代細(xì)胞上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，并保持了細(xì)胞的純凈性和良好的病毒增殖能力。 通過(guò)對(duì)豬瘟兔化弱毒疫苗株ST、BT細(xì)胞毒E2基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較和分析，發(fā)現(xiàn)豬瘟兔化弱毒疫苗株BT細(xì)胞、ST細(xì)胞毒與標(biāo)準(zhǔn)參考毒株AY663656-C81(豬瘟兔化弱毒疫苗株P(guān)K15細(xì)胞毒)同源性相對(duì)較高，核苷酸和氨基酸序列同源性分別達(dá)到99.0％～99.4％和98.7％～99.7％，與標(biāo)準(zhǔn)參考毒株Z46258-C株的核苷酸和氨基酸序列的同源

5、性次之，即分別為98.7％～98.9％和98.4％～99.0％；繪制其E2基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)，明確了兩種豬瘟兔化弱毒疫苗株ST、BT細(xì)胞毒的E2基因與AY663656-C81和標(biāo)準(zhǔn)Z46258-C疫苗株同屬于一個(gè)基因群，起源于標(biāo)準(zhǔn)Shimen豬瘟強(qiáng)毒株。 而且，在其E2蛋白抗原區(qū)的氨基酸差異分析比較中，發(fā)現(xiàn)豬瘟兔化弱毒疫苗株ST細(xì)胞毒與標(biāo)準(zhǔn)C疫苗株在誘導(dǎo)中和抗體的A、B、C三個(gè)抗原區(qū)內(nèi)無(wú)一氨基酸差異，豬瘟兔化弱毒疫苗株BT細(xì)胞毒在

6、誘導(dǎo)中和抗體的A、B、C、D四個(gè)抗原區(qū)內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)C疫苗株的氨基酸僅有細(xì)微差異，證實(shí)了豬瘟病毒分子結(jié)構(gòu)的遺傳穩(wěn)定性，進(jìn)一步從分子生物學(xué)的角度顯示了豬瘟兔化弱毒疫苗株在適應(yīng)ST細(xì)胞、BT細(xì)胞后，并沒(méi)有影響疫苗細(xì)胞毒的抗原性?？傊?，本研究系統(tǒng)地闡明了豬瘟兔化弱毒疫苗株在豬睪丸細(xì)胞和牛睪丸細(xì)胞上培養(yǎng)增殖情況，從分子遺傳演化分析的角度，進(jìn)一步明確豬瘟兔化弱毒疫苗株sT、BT細(xì)胞毒的主要保護(hù)性抗原E2蛋白在A、B、C、D四個(gè)抗原區(qū)內(nèi)的變異情況，確保疫