豬瘟兔化弱毒疫苗株細胞毒E2基因的克隆與序列分析.pdf

1、本論文對豬瘟兔化弱毒疫苗株在豬睪丸(ST)細胞和牛睪丸(BT)細胞上培養(yǎng)適應性、病毒增殖能力及細胞的純凈性方面進行了系統(tǒng)研究；從分子水平的角度，分析和比較了豬瘟兔化弱毒疫苗株ST細胞和BT細胞毒的主要保護性抗原E2蛋自在抗原編碼區(qū)內(nèi)氨基酸的變異情況，同時對其核苷酸序列和推導的氨基酸序列進行同源性分析，并應用遺傳進化樹理論對其E2基因的來源及其分子遺傳衍化規(guī)律進行研究。 本實驗所用的豬瘟兔化弱毒疫苗株分別在ST細胞和BT細胞上培養(yǎng)

2、增殖后，從病毒感染的細胞液中直接提取核酸。應用Oligo(6.0版本)引物設計分析軟件設計豬瘟病毒(CSFV)E2基因片段的特異性PCR引物，通過反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法擴增兩種豬瘟兔化弱毒疫苗株細胞(ST、BT)毒E2基因的cDNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)分離純化后克隆到pMD 18-T載體中，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定純化后進行序列測定，然后應用DNAstar軟件進行序列的拼接、序列信息編輯和分析。同時從GenBank中

3、下載了豬瘟兔化弱毒疫苗株P(guān)K15細胞毒株、石門強毒標準株以及豬瘟標準C-株的E2基因序列，分析了豬瘟兔化弱毒疫苗株ST、BT細胞毒E2基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列的同源性和差異性，繪制遺傳進化樹，以闡明豬瘟兔化弱毒疫苗株在適應了ST細胞和BT細胞后，ST、BT細胞毒主要保護性抗原的變異情況及其遺傳演化規(guī)律。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬瘟兔化弱毒疫苗株經(jīng)ST細胞和BT細胞培養(yǎng)增殖后，豬瘟兔化弱毒疫苗株不僅在BT細胞上具有良好的適應性，

4、而且在ST傳代細胞上生長狀態(tài)良好，并保持了細胞的純凈性和良好的病毒增殖能力。 通過對豬瘟兔化弱毒疫苗株ST、BT細胞毒E2基因的核苷酸和氨基酸序列進行比較和分析，發(fā)現(xiàn)豬瘟兔化弱毒疫苗株BT細胞、ST細胞毒與標準參考毒株AY663656-C81(豬瘟兔化弱毒疫苗株P(guān)K15細胞毒)同源性相對較高，核苷酸和氨基酸序列同源性分別達到99.0％～99.4％和98.7％～99.7％，與標準參考毒株Z46258-C株的核苷酸和氨基酸序列的同源

5、性次之，即分別為98.7％～98.9％和98.4％～99.0％；繪制其E2基因的遺傳進化樹，明確了兩種豬瘟兔化弱毒疫苗株ST、BT細胞毒的E2基因與AY663656-C81和標準Z46258-C疫苗株同屬于一個基因群，起源于標準Shimen豬瘟強毒株。 而且，在其E2蛋白抗原區(qū)的氨基酸差異分析比較中，發(fā)現(xiàn)豬瘟兔化弱毒疫苗株ST細胞毒與標準C疫苗株在誘導中和抗體的A、B、C三個抗原區(qū)內(nèi)無一氨基酸差異，豬瘟兔化弱毒疫苗株BT細胞毒在

6、誘導中和抗體的A、B、C、D四個抗原區(qū)內(nèi)與標準C疫苗株的氨基酸僅有細微差異，證實了豬瘟病毒分子結(jié)構(gòu)的遺傳穩(wěn)定性，進一步從分子生物學的角度顯示了豬瘟兔化弱毒疫苗株在適應ST細胞、BT細胞后，并沒有影響疫苗細胞毒的抗原性?？傊?，本研究系統(tǒng)地闡明了豬瘟兔化弱毒疫苗株在豬睪丸細胞和牛睪丸細胞上培養(yǎng)增殖情況，從分子遺傳演化分析的角度，進一步明確豬瘟兔化弱毒疫苗株sT、BT細胞毒的主要保護性抗原E2蛋白在A、B、C、D四個抗原區(qū)內(nèi)的變異情況，確保疫