Kisspeptin-10對(duì)鵪鶉產(chǎn)蛋啟動(dòng)及肝臟脂代謝的影響研究.pdf

1、Kisspeptin-10，-14和-13為kisspeptin-54的裂解產(chǎn)物，由Kiss-1基因編碼，均是G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor, GPR54)的內(nèi)源性配體。不同物種間，kisspeptin-10的氨基酸序列高度保守。然而，迄今有關(guān)Kisspeptin對(duì)禽類生殖活動(dòng)的影響研究較少，僅見兩篇文獻(xiàn)報(bào)道。已有資料顯示，鴨下丘腦存在kisspeptin的陽性表達(dá)，且具有調(diào)節(jié)生殖軸下丘腦-垂體-性

2、腺軸（hypothalamus-pituitary-gonads，HPG）激素分泌的功能。雌激素是卵巢分泌的甾體類激素，可反饋調(diào)節(jié)生殖軸的分泌活動(dòng)，在外周可直接促進(jìn)血脂和脂肪酸合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)。禽類產(chǎn)蛋過程也是能量的富集過程，脂質(zhì)含量占禽蛋重的10％。肝臟是禽類脂代謝的主要器官。因此，本試驗(yàn)結(jié)合體內(nèi)、體外研究方法，探討kisspeptin對(duì)禽類開產(chǎn)過程中脂代謝的影響及可能機(jī)制。
　　 1、Kisspeptin-10對(duì)雌鵪鶉肝臟

3、脂代謝的影響及機(jī)制研究本實(shí)驗(yàn)選用75羽22日齡雌鵪鶉，隨機(jī)分為三組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只:腹腔注射300μL生理鹽水組（對(duì)照組，Con），注射0.1nmol kisspeptin-10(低劑量組，L)和1 nmol kisspeptin-10組（高劑量組，H），每日注射一次，連續(xù)注射3周。記錄鵪鶉開產(chǎn)情況并于60日齡時(shí)采集血液和肝臟組織，用放射性免疫方法檢測血清中雌二醇（estradiol，E2）含量;用生化分析法測定血清中總膽固

4、醇(total cholesterol，Tch)、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C）、游離脂肪酸（non-esterified fatty acid, NEFA）、葡萄糖(glucose)、載脂蛋白B(apoprot

5、ein B，ApoB)和A1(apoprotein A1，ApoA1)以及肝臟中TG、Tch、HDL-C和LDL-C的含量。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測肝臟中以下關(guān)鍵因子和酶的基因表達(dá)水平:固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element-binding proteins1，SREBP-1）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP-2)、脂肪酸合成酶（fatty acid synthestase，F(xiàn)AS）、

6、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylaseα，ACCα)、硬脂酰輔酶A脫氫酶(stearylcoenzyme A dehydrogenase1，SCD1)、蘋果酸酶(malic enzyme，ME)、3-羥-3-甲基戊二酸單酰CoA還原酶（3-hydroxyl-3-methyl glutaryl-coenzyme A reductases，HMGCR）和膽固醇7α-羥化酶(cholesterol7α-h

7、ydroxylase，CYP7A1)、載脂蛋白:ApoVLDL-Ⅱ、ApoB、ApoA1;脂肪酸結(jié)合蛋白2（fatty acid binding protein2，F(xiàn)ABP2）及卵黃蛋白原-Ⅱ(vitellogenin-Ⅱ，VTG-Ⅱ)、雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)、β（estrogenreceptorβ，ERβ）mRNA，以及以SREBP-1為靶的microRNAs（miRNAs）的表達(dá)水平;并采用we

8、stern blot方法檢測SREBP-1、SREBP-2和ERα蛋白水平。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，L組和H組鵪鶉產(chǎn)蛋率分別顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01)升高;注射kisspeptinp-10增加血液E2濃度，且于高劑量時(shí)達(dá)統(tǒng)計(jì)顯著水平(P＜0.05);H組鵪鶉血清Tch和HDL-C濃度顯著降低(P＜0.05)，肝臟TG和Tch含量分別極顯著(P＜0.01)和顯著增加(P＜0.05);H組鵪鶉肝臟SREBP-1、FAS、A

9、poVLDL-Ⅱ mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）、VTG-Ⅱ和CYP7A1 mRNA表達(dá)極顯著增加（P＜0.01），其他基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(P＞0.05);肝臟SREBP-1和ERα蛋白表達(dá)分別極顯著（P＜0.01）和顯著(P＜0.05)增加，而SREBP-2蛋白表達(dá)各組間沒有顯著差異(P＞0.05)。以上結(jié)果提示:產(chǎn)蛋前連續(xù)注射kisspeptin-10可顯著提高鵪鶉產(chǎn)蛋率、增加雌激素的分泌、增強(qiáng)肝臟脂合成及沉積到卵巢中的

10、能力，這可能與kisspeptin-10上調(diào)相關(guān)酶和因子的表達(dá)有關(guān)。
　　 2、kisspeptin-10對(duì)雞胚肝細(xì)胞脂代謝的影響及其作用機(jī)制選取14胚齡海蘭蛋雞雞胚，分離純化肝細(xì)胞，有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1d后采用無血清培養(yǎng)基（0.1％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒，insulin-transferrin-Se，ITS）培養(yǎng)。在無血清培養(yǎng)基穩(wěn)定24 h后，用Kisspeptin-10(Kp-10)處理細(xì)胞，24 h后，收集細(xì)胞上清及細(xì)胞，分別

11、檢測細(xì)胞活力（MTT法）和細(xì)胞中TG、Tch、HDL-C和LDL-C含量;細(xì)胞中脂代謝相關(guān)因子和酶的轉(zhuǎn)錄水平，包括:FAS、ACCα、SCD-1、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(carnitine palmityl transferase1,CPTl)、ME、SREBP-1、SREBP-2、HMGCR、ApoVLDL-Ⅱ、ApoB、ApoA1和FABP2基因，以及以SREBP-1為靶的miRNAs的表達(dá)水平表達(dá)水平;western blot方法檢

12、測細(xì)胞中SREBP-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示:1、100和1000 nM Kp-10處理對(duì)無血清培養(yǎng)的肝細(xì)胞活力無顯著影響，100 nM時(shí)可顯著促進(jìn)TG、HDL-C、LDL-C的合成(P＜0.05)。2、在100 nM Kp-10處理下，SREBP-1和ACCα mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）;SCD-1 mRNA表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.01）;FAS和ApoA1基因表達(dá)具有降低的趨勢（P=0.08和0.075），而ApoVLDL