芍藥GA-20氧化酶基因的克隆和功能分析.pdf

1、芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）隸屬于芍藥科芍藥屬，是重要的宿根花卉，長(zhǎng)期演化過(guò)程中，形成了芽冬季休眠的特性?？寺〔⒀芯垦啃菝呓獬^(guò)程中重要基因，是解析芍藥芽?jī)?nèi)休眠分子機(jī)理的重要內(nèi)容。
　　赤霉素（gibberellins，GAs）作為一種重要的植物激素，參與控制種子、芽的萌發(fā)，莖的伸長(zhǎng)，葉片伸展，根的生長(zhǎng)以及花和果實(shí)的發(fā)育等多種植物發(fā)育和生理過(guò)程。前人研究表明：赤霉素可以完全代替或部分代替低溫解除或輔助解

2、除休眠。GA20–氧化酶（GA20ox）是赤霉素生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，調(diào)控具有活性GAs的生物合成數(shù)量。因此，從分子生物學(xué)水平闡明GA20ox基因與芍藥內(nèi)休眠的關(guān)系，可能為提前解除內(nèi)休眠提供新策略，具有重要理論和實(shí)踐意義。迄今為止，芍藥中尚未分離到GA20ox基因。為此，本研究擬基于前期的芍藥芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆芍藥GA20ox基因的cDNA全長(zhǎng)序列，著重研究其在芍藥芽?jī)?nèi)休眠解除進(jìn)程中的表達(dá)特性，并進(jìn)行了簡(jiǎn)單的功能鑒定，以期進(jìn)一步揭

3、示其生物學(xué)功能，并為闡明芍藥芽?jī)?nèi)休眠解除的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要研究結(jié)論如下：
　?。?）克隆了芍藥赤霉素生物合成途徑中的GA20ox基因的cDNA全長(zhǎng)序列。GenBank登錄號(hào)為KU886552，該基因cDNA序列全長(zhǎng)1351 bp，開(kāi)放閱讀框1146 bp，共編碼381個(gè)氨基酸；
　?。?）PlGA20ox蛋白分子量為43209.1 Da，為穩(wěn)定蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，無(wú)信號(hào)肽，屬于C19-GAoxs。含有高度保守的2

4、0G-Fe(II)-Oxy蛋白結(jié)構(gòu)域、Fe2+結(jié)合位點(diǎn)和2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)。與牡丹GA20ox同源性高達(dá)96％，親緣關(guān)系最近，說(shuō)明GA20ox基因在遺傳進(jìn)化方面較為保守且符合遺傳進(jìn)化規(guī)律；
　　（3）芍藥GA20ox基因在芽中表達(dá)豐度最高，其次是花瓣，而在根、萼片、葉片及莖中表達(dá)微弱，說(shuō)明該基因?qū)儆诮M成型表達(dá)基因，但表達(dá)水平存在較明顯差異；
　　（4）在低溫解除芍藥芽?jī)?nèi)休眠進(jìn)程中，PlGA20ox表達(dá)水平呈先上升后總體下降

5、趨勢(shì)，且與內(nèi)源GA3含量成顯著正相關(guān)（r=0.901*）；外施赤霉素會(huì)明顯增加內(nèi)源GA3含量，但同時(shí)抑制PlGA20ox的表達(dá)，說(shuō)明PlGA20ox調(diào)控GA3的合成，同時(shí)受植物體內(nèi)活性GA3含量的負(fù)反饋調(diào)節(jié)；
　　（5）構(gòu)建融合表達(dá)載體pROKII-PlGA20ox-GFP，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬時(shí)表達(dá)本生煙（Nicotiana benthamiana）葉片顯示：PlGA20ox蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。
　?。?）異源轉(zhuǎn)化擬南芥，對(duì)