馬鈴薯赤霉素合成代謝途徑關(guān)鍵酶基因GA2ox1、GA20ox1的克隆與功能分析.pdf

1、赤霉素（GA）作為植物體內(nèi)一種內(nèi)源激素，在高等植物生長(zhǎng)的整個(gè)生命周期，起著重要的調(diào)控作用。GA-20氧化酶和GA-2氧化酶是赤霉素合成途徑中第三階段的關(guān)鍵酶，它們均由多基因家族編碼，參與著赤霉素水平的調(diào)控。GA-20氧化酶能促進(jìn)活性赤霉素的合成，屬于正向調(diào)控；而GA-2氧化酶則會(huì)將活性赤霉素轉(zhuǎn)化為非活性的赤霉素，屬負(fù)向調(diào)控。所以GA20ox基因和GA2ox基因的表達(dá)水平，將會(huì)影響到植物體內(nèi)活性GA的合成，最終影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究首

2、先以株高突變馬鈴薯植株為材料，建立了外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)方法，并測(cè)定植株體內(nèi)的赤霉素合成關(guān)鍵酶基因在不同時(shí)期不同組織內(nèi)的表達(dá)量，分析表達(dá)差異，以明確赤霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平與植株株高間的關(guān)系。以馬鈴薯青薯9號(hào)為材料，克隆了GA20ox1基因和GA2ox1基因，分析了序列特征，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化分析了過量表達(dá)目的基因?qū)︸R鈴薯植株的影響。從分子水平闡明了兩基因的可能作用機(jī)理。
　　本研究主要內(nèi)的榮包括：⑴利用實(shí)時(shí)熒光

3、定量 PCR方法估算出了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中外源基因T-DNA的插入拷貝數(shù)，在所測(cè)的23株轉(zhuǎn)基因株系中，12株為單拷貝插入，6株為雙拷貝，5株為多拷貝，并通過對(duì)田間馬鈴薯農(nóng)藝性狀的分析。建立了快速檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的方法。⑵利用Real-time PCR方法，對(duì)赤霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因在馬鈴薯突變體材料M4P9中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，在馬鈴薯生長(zhǎng)的不同時(shí)期，以及各時(shí)期內(nèi)的根、莖、葉中，各基因的表達(dá)量均發(fā)生了一定變化，CPS1基因在

4、幼苗期的過量表達(dá)為植株的生長(zhǎng)提供了充足的內(nèi)源激素，GA20ox1基因在莖中變化明顯，主要表現(xiàn)為在膨大期莖中的過量表達(dá)，可能與塊莖淀粉累積有關(guān)， GA2ox1基因在塊莖形成期莖中的過量表達(dá)，抑制了內(nèi)源GA的合成，被認(rèn)為是促使 M4P9植株矮小的因素之一。外源噴施活性 GA3能抑制植物體內(nèi)自身活性GA的合成，主要表現(xiàn)為馬鈴薯植株體內(nèi)赤霉素相關(guān)酶基因表達(dá)量的下降。⑶克隆了馬鈴薯赤霉素合成途徑中的StGA2ox1基因，測(cè)序得 CDS全長(zhǎng)1005

5、bp，編碼334個(gè)氨基酸。經(jīng)對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，α-螺旋為34.43％、無規(guī)則卷曲為34.13％、延伸主鏈為22.16％、β-轉(zhuǎn)角為9.28％，為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，克隆得到的馬鈴薯GA2ox1基因編碼的氨基酸序列與番茄GA2ox2基因、煙草GA2ox1、GA2ox2、GA2ox3基因的同源性較高，而與番茄 GA2ox1基因的同源性最低。與 NCBI上的GA2ox1（LOC102605134）基因序列相

6、比，青薯9號(hào)中GA2ox1基因序列對(duì)應(yīng)的其編碼氨基酸也發(fā)生了一定的改變。⑷克隆了馬鈴薯赤霉素合成途徑中的StGA20ox1基因，測(cè)序得CDS全長(zhǎng)1137bp，編碼378個(gè)氨基酸，并對(duì)StGA20ox1基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)中α-螺旋為39.68％、無規(guī)則卷曲為33.33％、延伸主鏈為19.58％、β-轉(zhuǎn)角為7.41％，為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。同源性比對(duì)結(jié)果顯示， StGA20ox1與番茄GA20ox1基因、歐白英

7、GA20ox1基因、煙草GA20ox基因的同源性較高，而與牽?；ǖ?類 GA20ox基因的同源性都不高。與 NCBI上的GA20ox1（AJ291453.1）基因序列相比，青薯9號(hào)中GA20ox1基因序列在多處發(fā)生了改變（共29處），經(jīng)測(cè)序得青薯9號(hào)中的GA20ox1基因編碼氨基酸較已公布的StGA20ox1基因編碼的氨基酸，少了3個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸，少了4個(gè)疏水氨基酸，多了4個(gè)極性氨基酸。⑸改造并成功構(gòu)建了一個(gè)新的質(zhì)粒載體pCAEZ138

8、3。構(gòu)建了用于外源基因GA20ox1和 GA2ox1遺傳轉(zhuǎn)化用的植物表達(dá)載體1383-GA20ox1和1383-GA2ox1。經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化，獲得含外源GA20ox1基因的閩薯1號(hào)轉(zhuǎn)基因陽性苗7株；獲得含外源GA2ox1基因的青薯9號(hào)轉(zhuǎn)基因陽性苗1株。⑹利用熒光定量方法，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因陽性苗中， StGA2ox1基因和StGA20ox1基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中StGA2ox1基因和 StGA20ox1基因的表達(dá)量均有不

9、同程度的上調(diào)。經(jīng)表型性狀觀察，過量表達(dá)達(dá)StGA20ox1基因可促進(jìn)馬鈴薯植株株高生長(zhǎng)和根的伸長(zhǎng)。在青薯9號(hào)轉(zhuǎn)基因植株中，StGA2ox1基因拷貝數(shù)為6；在閩薯1號(hào)轉(zhuǎn)基因株系中，StGA20ox1基因拷貝數(shù)分別為3、2、4、2、2、4和2個(gè)。⑺半定量PCR結(jié)果表明，過量表達(dá)StGA2ox1基因能不同程度的增加植株對(duì)非生物脅迫的抗逆性，在干旱脅迫下，StGA2ox1轉(zhuǎn)基因株系較對(duì)照材料具有相對(duì)高的葉綠素含量、游離脯氨酸含量、相對(duì)葉片含水量