卡介菌多糖核酸對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞和雞外周血淋巴細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)是從卡介菌中經(jīng)熱酚法提取的多糖、核酸的生物活性物質(zhì)，主要用于預(yù)防和治療慢性支氣管炎、感冒等，近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)它還具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等作用，且在臨床上被廣泛使用。但是BCG-PSN在獸醫(yī)臨床應(yīng)用上則鮮有報(bào)道，尤其是BCG-PSN深層次作用機(jī)理的研究更是少見;同時(shí)，作為一種多糖與核酸的混合物，BCG-PSN中多糖、核酸的確切成分、兩種組份單獨(dú)的藥效情況以及多糖、核酸之間的相互作用均知之甚少，從而

2、嚴(yán)重制約了BCG-PSN在獸醫(yī)臨床上的具體應(yīng)用。為解決這些問題，我們進(jìn)行了BCG-PSN提取、組份分離試驗(yàn)，并利用提取的BCG-PSN對(duì)體外培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞及雞外周血淋巴細(xì)胞誘發(fā)的凋亡作用了進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　 BCG-PSN對(duì)離體培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞凋亡作用的研究試驗(yàn)
　　 采用超聲波破碎、熱酚處理、透析醇沉的優(yōu)化方案，從卡介苗中提取得到了純度較高的卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)，并利用提取得到的BCG-PSN對(duì)離

3、體培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)進(jìn)行藥物處理，采用MTT檢測(cè)技術(shù)、顯微檢測(cè)技術(shù)、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)、分光光度法檢測(cè)技術(shù)等，就BCG-PSN對(duì)離體培養(yǎng)CEF生長(zhǎng)的細(xì)胞抑制效果、BCG-PSN在不同時(shí)間和不同藥物濃度下對(duì)離體培養(yǎng)CEF的細(xì)胞形態(tài)、凋亡變化以及由此引發(fā)的細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的動(dòng)態(tài)變化等進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。研究結(jié)果顯示，隨著BCG-PSN使用濃度的升高，CEF生長(zhǎng)活性呈現(xiàn)出先升高

4、、后降低的現(xiàn)象，說明BCG-PSN作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，適度濃度時(shí)可增強(qiáng)細(xì)胞活性，而當(dāng)藥物濃度過大時(shí)，反而會(huì)明顯降低細(xì)胞活性;CEF活性明顯降低的主要表現(xiàn)為CEF出現(xiàn)變形、變圓，細(xì)胞核出現(xiàn)深染、邊聚等現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多;凋亡蛋白Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的濃度與對(duì)照組細(xì)胞相比也出現(xiàn)了顯著差異，當(dāng)BCG-PSN濃度過大時(shí)，CEF凋亡蛋白Caspase-3，Caspase-9的濃度反而出現(xiàn)下降，說明過高

5、濃度的BCG-PSN可直接導(dǎo)致CEF的壞死而非以凋亡的方式發(fā)生死亡;隨著與BCG-PSN作用時(shí)間的延長(zhǎng)，CEF的活性明顯下降，凋亡蛋白Caspase-3，Caspase-9的濃度也呈現(xiàn)出先升高、后下降的現(xiàn)象，說明可以通過控制BCG-PSN的濃度、增加藥物作用的時(shí)間而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 BCG-PSN對(duì)離體培養(yǎng)雞外周血淋巴細(xì)胞凋亡作用的研究試驗(yàn)
　　 采用DEAE-纖維素陰離子柱層析法對(duì)自行提取的卡介菌多糖核酸(B

6、CG-PSN)進(jìn)行組份分離，得到 BCG-PSN、卡介菌多糖(BCG-PSA)與卡介菌核酸(BCG-NA)的粗分離組份，利用BCG-PSN、BCG-PSA及BCG-NA對(duì)離體培養(yǎng)的雞外周血淋巴細(xì)胞(PBL)進(jìn)行藥物處理，通過Trypan blue檢測(cè)技術(shù)、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)、分光光度法檢測(cè)技術(shù)、顯微檢測(cè)技術(shù)等，就BCG-PSN、BCG-PSA及BCG-NA對(duì)離體培養(yǎng)PBL的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效果、不同時(shí)間和不同藥物濃度對(duì)離體培養(yǎng)PBL的細(xì)胞凋亡

7、數(shù)目及由此引發(fā)的細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的動(dòng)態(tài)變化等進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。結(jié)果顯示，BCG-PSN在低濃度時(shí)有增強(qiáng)細(xì)胞活性的功效，而當(dāng)藥物濃度過大時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞活性明顯降低;當(dāng)BCG-PSN的濃度達(dá)到1000μg/mL時(shí)，PBL凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加，凋亡蛋白Caspase-3，Caspase-9的濃度與空白對(duì)照組細(xì)胞相比也出現(xiàn)了顯著差異。BCG-PSN濃度較低時(shí)，有抑制PBL凋亡和壞死的效應(yīng)