延邊黃牛成纖維細(xì)胞凋亡及調(diào)控的研究.pdf

1、目前延邊黃牛體細(xì)胞克隆技術(shù)已經(jīng)取得了顯著的成就，但是克隆胚胎發(fā)育率低下仍然是亟待解決的問題之一。有研究表明這可能與體外操作和培養(yǎng)過程中卵母細(xì)胞、供核細(xì)胞以及重組胚的細(xì)胞過度凋亡有關(guān)。因此設(shè)計本試驗，以研究體外供核細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞生長狀態(tài)，并試圖通過影響B(tài)cl-2/Bax比率抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　目的：（1）檢測延邊黃牛不同傳代次數(shù)的耳部成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征；（2）測定特定條件應(yīng)激下不同代數(shù)延邊黃牛成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活

2、力；（3）克隆并測定延邊黃牛Bax基因和Bcl-2基因相關(guān)序列；（4）探究H2O2對延邊黃牛體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的影響及損傷模型的確定；（5）探究siRNA轉(zhuǎn)染對延邊黃牛成纖維細(xì)胞活性的影響（6）測定siRNA轉(zhuǎn)染對延邊黃牛成纖維細(xì)胞Bax基因和Bcl-2基因表達(dá)的影響。
　　方法與內(nèi)容：（1）體外培養(yǎng)并獲取延邊黃牛的成纖維細(xì)胞系，并對指定代數(shù)細(xì)胞進行圖像采集；（2）對體外培養(yǎng)的不同代數(shù)延邊黃牛成纖維細(xì)胞分別進行冷凍處理、H2O2

3、刺激，再進行MTT活力測定，并與正常傳代的細(xì)胞進行對比；（3）用延邊黃牛耳成纖維細(xì)胞提取的總RNA做模版，反轉(zhuǎn)錄PCR擴增相應(yīng)基因，然后克隆到T載體上，再經(jīng)過轉(zhuǎn)化菌擴增后提取重組質(zhì)粒進行鑒定和序列分析；（4）用不同濃度H2O2處理處于對數(shù)期的延邊黃牛成纖維細(xì)胞，特定作用時間后測定細(xì)胞活力；（5）設(shè)計并合成相應(yīng)基因siRNA,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后測定細(xì)胞活力；（6）以轉(zhuǎn)染siRNA的延邊黃牛成纖維細(xì)胞總RNA為模版，擴增各組別細(xì)胞Bax基因

4、和Bcl-2基因并電泳檢測產(chǎn)物，用相關(guān)軟件對目的條帶亮度進行分析。
　　結(jié)果與討論：（1）試驗中的各代數(shù)延邊黃牛成纖維細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上并無明顯差異；（2）正常傳代的4、7、10和13代延邊黃牛成纖維細(xì)胞活力差異不顯著；玻璃化冷凍再復(fù)蘇的4代和7代延邊黃牛成纖維細(xì)胞差異不顯著，但均與10代與13代差異顯著；H2O2處理后4代和7代細(xì)胞無明顯差異但與10代差異顯著，13代細(xì)胞活力最低并與前三者均差異顯著；表明隨著細(xì)胞代數(shù)的增加細(xì)胞對外界

5、環(huán)境的抗性也在隨之下降；（3）成功克隆了延邊黃牛Bax基因CDS區(qū)112bp序列和Bcl-2基因365bp序列，并發(fā)現(xiàn)與已公布黃牛對應(yīng)序列是一致的，表明延邊黃牛該基因相對比較保守；（4）100μM H2O2處理組與空白組差異不明顯，200μM H2O2處理3h時成纖維細(xì)胞活力顯著下降，并在后期有恢復(fù)現(xiàn)象；400μM以上組細(xì)胞活力只呈現(xiàn)出下降的趨勢，無明顯恢復(fù)跡象。表明400μM以上濃度對細(xì)胞毒性過大，合適誘導(dǎo)的H2O2濃度和處理時間是2

6、00μM處理1h；（5）相對于未干擾組，siRNA干擾組細(xì)胞活力均有不同程度上升，除13代細(xì)胞外其他組細(xì)胞活力間顯著性差異，表明利用 siRNA轉(zhuǎn)染的方法可以提高延邊黃牛耳成纖維細(xì)胞的抗凋亡能力；（6）轉(zhuǎn)染 Bax-siRNA后，細(xì)胞內(nèi) Bax水平顯著下降，而對 Bcl-2表達(dá)影響不大，致使 Bcl-2/Bax比率上升。H2O2模型誘導(dǎo)的成纖維的細(xì)胞凋亡可能是通過 Bcl-2家族介導(dǎo)的，而 siRNA的轉(zhuǎn)染有望抑制因 H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞