Toll樣受體7在新城疫病毒誘導(dǎo)雞胚成纖維細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、本試驗(yàn)從能夠特異性識(shí)別ssRNA(single strand RNA)的模式識(shí)別受體TLR7及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入手，對(duì)屬于ssRNA病毒的NDV引起CEF凋亡機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 首先，采用Trizol法抽提NDV感染組和正常對(duì)照組CEF總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank上已發(fā)表的chTLR7、chMyD88、chIFN-α和chIL-2基因序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)各自特異性引物。以chβ-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量

2、PCR法檢測(cè)CEF中chTLR7、chMyD88、chIFN-α和chIL-2基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEF感染NDV后12h、24h、36h和48h，其chTLR7表達(dá)量與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，除24h外，表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組；chMyD88表達(dá)量均較對(duì)照組明顯升高(P<0.05或P<0.01)；chIFN-α表達(dá)量除在24h與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)外，其余均較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)；chIL

3、-2表達(dá)量也均較對(duì)照組明顯升高(P<0.05或P<0.01)。CEF感染NDV后，chTLR7及其下游信號(hào)分子表達(dá)所呈現(xiàn)出的動(dòng)態(tài)變化表明，chTLR7參與了NDV感染CEF的早期過程。
　　 其次，根據(jù)GenBank已發(fā)表的chTLR7序列設(shè)計(jì)引物，成功克隆了chTLR7胞外區(qū)基因片段，大小為1122bp，同時(shí)成功構(gòu)建了pGEX-6P-1-chTLR7原核表達(dá)質(zhì)粒，其表達(dá)蛋白大小約為63KDa。利用此重組蛋白制備兔抗chTLR7

4、多克隆抗體，經(jīng)Western blotting及間接免疫熒光試驗(yàn)證明，制備的兔抗chTLR7多克隆抗體具有良好的特異性。將此抗體與培養(yǎng)的CEF作用，阻斷CEF細(xì)胞內(nèi)的chTLR7受體后再感染NDV，檢測(cè)CEF凋亡的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NDV感染后48h，使用25倍稀釋chTLR7多抗處理的CEF，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，且與NDV感染組比較差異極顯著(P<0.01)；28倍稀釋chTLR7多抗處理的CEF，細(xì)胞凋亡數(shù)量較NDV感染組顯著