甲狀腺相關(guān)性眼病B淋巴細(xì)胞和眼眶成纖維細(xì)胞的復(fù)合培養(yǎng)及其調(diào)控.pdf

1、目的：
　　 1.分離、培養(yǎng)和鑒定人外周血B淋巴細(xì)胞和眼眶成纖維細(xì)胞，復(fù)合培養(yǎng)兩細(xì)胞，建立起具有自身免疫特性的甲狀腺相關(guān)眼?。═AO）體外復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞模型。為進(jìn)一步研究B細(xì)胞和眼眶成纖維細(xì)胞之間的相互作用，且證明B細(xì)胞在TAO的發(fā)病機(jī)制中起到一定的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 2.通過體外觀察眼眶成纖維細(xì)胞胰島素生長因子-1受體（IGF-1R）的表達(dá)，動態(tài)、定量檢測復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞模型中炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，探討TAO可能

2、的發(fā)病機(jī)制。
　　 3.通過應(yīng)用B細(xì)胞抑制劑利妥昔單抗（Rituximab，RTX）和IGF-1R的結(jié)合蛋白，調(diào)控復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞模型中的炎性細(xì)胞因子和趨化因子，從而探討TAO細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)不同水平上的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新的思路。
　　 方法：
　　 1.原代培養(yǎng)15例TAO患者及15例正常人的眼眶成纖維細(xì)胞，免疫組化法鑒定其性質(zhì)，MTT法描繪細(xì)胞生長曲線；用免疫磁珠分離外周血技術(shù)+CpG刺激+細(xì)胞培養(yǎng)法，

3、純化、培養(yǎng)10例TAO患者及10例正常人的外周血B淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定其性質(zhì)及純度。按成纖維細(xì)胞與B細(xì)胞1:20的比例建立復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞模型。
　　 2.流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡觀察比較正常人和TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞IGF-1R的差別。ELISA法比較各組復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞模型24h、48h、72h炎性細(xì)胞因子IL-6和趨化因子RATNTES的表達(dá)。
　　 3.MTS法比較不同作用濃度及不同作用時間B細(xì)胞抑制物RTX對B細(xì)

4、胞的抑制作用；ELISA法觀察RAX和IGF-1R結(jié)合蛋白作用于復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞后對IL-6和RANTES表達(dá)的抑制作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外成功培養(yǎng)并鑒定了眼眶成纖維細(xì)胞及外周血B淋巴細(xì)胞，建立了TAO復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞模型。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微觀察均發(fā)現(xiàn)TAO患者的眼眶成纖維細(xì)胞上IGF-1R的表達(dá)明顯高于正常人。
　　 3.24h復(fù)合培養(yǎng)各實驗組的IL-6和RANTES的表達(dá)均升高，其

5、中T+T組（甲狀腺相關(guān)眼病患者的B淋巴細(xì)胞與患者的眼眶成纖維細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)組）的IL-6和RANTES水平最高。
　　 4.用RTX、IGF-1R結(jié)合蛋白作用于T+T組復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞模型，在48h上清液中檢測到的炎性細(xì)胞因子IL-6和趨化因子RANTES的濃度明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.本課題建立的TAO眼眶成纖維細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)的模型，對自身免疫性疾病有一定的針對性，證明了B淋巴細(xì)胞與眼眶成纖維細(xì)