高抗性耐貯轉(zhuǎn)基因獼猴桃的選育及適應(yīng)性研究.pdf

1、紅陽獼猴桃原產(chǎn)于四川省蒼溪縣，因其口感好，肉質(zhì)細(xì)膩，具有極高的開發(fā)利用價值。但紅陽獼猴桃因?yàn)榭共⌒圆?，果?shí)貯藏期太短等原因，常給果農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，不利于推廣種植。為建立獼猴桃基因功能研究技術(shù)平臺并通過生物技術(shù)改良獼猴桃,本研究以海沃德獼猴桃為實(shí)驗(yàn)材料，克隆得到獼猴桃 ACO基因，通過反義 RNA技術(shù)轉(zhuǎn)化紅陽獼猴桃，抑制其乙烯的產(chǎn)生，從而達(dá)到延長果實(shí)貯藏期的目的，另外選擇高抗性的砧木對轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行嫁接，以解決抗病性差的缺點(diǎn)，從而選育

2、出一個耐貯且高抗病性的紅陽獼猴桃新品種。
　　獼猴桃葉片中由于酚類和糖類物類含量過多，常規(guī)的方法很難從中提取出獼猴桃基因組 DNA和總 RNA。本實(shí)驗(yàn)通過在提取緩沖液中添加一定比例的PVP-40和β-巰基乙醇，有效的防止了酚類物質(zhì)的氧化和多糖類物質(zhì)的干擾。成功從獼猴桃葉片中的得到了高質(zhì)量的基因組 DNA和總 RNA，完全能夠滿足 PCR鑒定和Southern分子雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。
　　從海沃德獼猴桃葉片中提取總 R

3、NA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,并以 cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到大小長約1 Kb的獼猴桃 ACO基因的全長片段。通過中間載體pJIT163和表達(dá)載體pCAMBJA1300成功構(gòu)建了該基因的反義表達(dá)載體。
　　以紅陽獼猴桃?guī)а壳o段和葉片為外植體，研究其愈傷誘導(dǎo)、分化出芽、生根及練苗等過程，完善了其組培體系，并建立了一個高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅陽獼猴桃遺傳轉(zhuǎn)化體系，為通過分子生物學(xué)的手段來研究和改良紅陽獼猴桃提供了一個

4、很好的技術(shù)平臺。共獲得47株潮霉素抗性植株,隨機(jī)挑選其中14株經(jīng)跨35 S啟動子，和跨 CaMV終止子的PCR鑒定,其中7株在兩次檢測中都擴(kuò)增得到了目的條帶,初步統(tǒng)計得出陽性植株占50％左右。實(shí)驗(yàn)證明本研究在世界上首次將獼猴桃的ACO基因的反義表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化中華獼猴桃，并獲得了再生植株。
　　為使得到的轉(zhuǎn)基因陽性植株提前掛果，而且增加紅陽獼猴桃的抗病性。本實(shí)驗(yàn)選用高抗病性的對萼獼猴桃(Actinidiavalvata)為砧木，進(jìn)