壬基酚和雙酚A對(duì)羅氏沼蝦的內(nèi)分泌干擾.pdf

1、內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(endocrine disrupting chemicals， EDC)，是指干擾生物體正常的內(nèi)分泌機(jī)能，并影響生物體或其后代發(fā)育、繁殖和行為的外源性化學(xué)物質(zhì)，由于它往往具有類雌激素作用，故又稱為環(huán)境雌激素(ecoestrogen)。壬基酚(Nonylphenol，NP)和雙酚A(Bisphenol A，BPA)是兩種典型的環(huán)境雌激素，研究報(bào)道，NP和BPA對(duì)于生物體內(nèi)分泌的干擾主要表現(xiàn)為雄性雌性化，而且可以通過(guò)食物鏈在

2、各級(jí)生物體內(nèi)轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期積累，最終干擾生物體的正常內(nèi)分泌功能。 關(guān)于各種NP和BPA的研究尚處于起步階段，研究對(duì)象也大多集中在脊椎動(dòng)物中，如大鼠、兩棲類、魚(yú)類等。對(duì)于甲殼類的EDC研究少有報(bào)道。生活在水環(huán)境中的甲殼動(dòng)物極易受到：EDC的作用，影響著生態(tài)穩(wěn)定和人類生存安全，開(kāi)展這方面研究無(wú)疑有著重要意義。 本研究以具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的羅氏沼蝦為研究對(duì)象，運(yùn)用RT—PCR和透射電鏡等實(shí)驗(yàn)方法，在個(gè)體和細(xì)胞水平展開(kāi)了急性毒性實(shí)驗(yàn)研

3、究(半致死濃度，LC<,50>)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷觀察(病理變化)、并在分子水平以VTG為生物標(biāo)志物對(duì)三種典型的環(huán)境雌激素壬基酚、雙酚A和雌二醇對(duì)雌、雄羅氏沼蝦的雌激素效應(yīng)分別進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)NP能夠?qū)α_氏沼蝦產(chǎn)生細(xì)胞毒性和雌激素效應(yīng)。 1．NP對(duì)羅氏沼蝦的急性毒性研究 研究注射了溶劑對(duì)照組、500 mg/kg、625 mg/kg、750 mg/kg、875 mg/kg和1000 mg/kgNP

4、后，96h內(nèi)NP對(duì)羅氏沼蝦的毒性效應(yīng)、中毒特征、半致死濃度并計(jì)算出安全濃度。旨在探索NP對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)和人類健康的潛在影響，并為后續(xù)的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷和VTG基因表達(dá)干擾的實(shí)驗(yàn)研究提供安全濃度參考依據(jù)。 結(jié)果得到：羅氏沼蝦對(duì)NP的敏感度隨NP濃度升高而增大，48 h后1000 mg/kg組試驗(yàn)蝦死亡率為100％；溶劑對(duì)照組和對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)存活率均為100％。利用Reed-MLlench法計(jì)算24 h、48 h、72 h和96

5、h的半致死濃度分別為937.5、812.5、625和583.3 mg/kg，安全濃度為183.1 mg/kg。 2.NP對(duì)羅氏沼蝦肌肉和肝胰腺損傷的研究 在50 mg/kg，100 mg/kg，150 mg/kgNP三個(gè)濃度下，觀察96h后細(xì)胞的損傷。 肝胰腺細(xì)胞對(duì)照組：胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，線粒體豐富，內(nèi)嵴發(fā)達(dá)，細(xì)胞核形狀規(guī)則，微絨毛排列整齊；50mg/kg組：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，部分空泡化，線粒體豐富，細(xì)胞核邊際不

6、清晰，部分溶解，微絨毛排列整齊；100mg/kg組：細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常豐富，部分空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的核糖體脫落，有大體積的線粒體出現(xiàn)，內(nèi)嵴清楚，細(xì)胞核邊際部分?jǐn)U張，微絨毛排列整齊，部分缺少；150mg/kg組：細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分?jǐn)U張，囊泡化，線粒體豐富，且內(nèi)嵴模糊，部分空泡化，細(xì)胞核邊際部分?jǐn)U張，微絨毛排列整齊； 肌細(xì)胞對(duì)照組：肌漿網(wǎng)豐富，線粒體豐富，肌漿網(wǎng)與T小管形成三聯(lián)體(Trlad)，肌原纖維明帶暗帶清晰可辨；50mg/kg組

7、：肌漿網(wǎng)豐富，水腫，細(xì)胞核膜輕微水腫，肌原纖維明暗帶模糊不可辨；100mg/kg組：核膜部分溶解，肌絲不清晰，肌膜部分溶解，線粒體內(nèi)嵴溶解，空泡化，肌絲扭曲、斷裂，間隔變大，肌漿網(wǎng)水腫，產(chǎn)生空白區(qū)；150mg/kg組：肌原纖維萎縮扭曲，線粒體內(nèi)嵴溶解，肌膜溶解，核膜溶解，胞質(zhì)中出現(xiàn)空白區(qū)。 結(jié)果表明，NP對(duì)羅氏沼蝦的毒性具有組織特異性，在相同濃度下，肌細(xì)胞的損傷嚴(yán)重，而肝細(xì)胞損傷輕微。 3.壬基酚和雙酚A對(duì)雄性羅氏沼蝦V

8、TG基因表達(dá)的影響 采取雄性羅氏沼蝦親蝦，肌肉注射NP和BPA。給藥濃度均為0、溶劑對(duì)照組、50、100、150 mg/kg進(jìn)行NP和BPA對(duì)肝胰腺VTG基因表達(dá)影響的劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)150 mg/kgNP和100mg/kgBPA進(jìn)行12天的時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。 劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NP和BPA均具有雌激素效應(yīng)，且NP的雌激素效應(yīng)大于BPA的雌激素效應(yīng)。三個(gè)劑量的NP對(duì)VTG的誘導(dǎo)都明顯高于對(duì)照組，150mg/kgNP對(duì)V

9、TG表達(dá)水平的誘導(dǎo)最高，NP對(duì)VTG的誘導(dǎo)表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)的趨勢(shì)；三個(gè)劑量的BPA對(duì)VTG水平都明顯高于對(duì)照組，100mg/kgBPA對(duì)VTG的誘導(dǎo)效應(yīng)最大，50mg/kgBPA與150mg/kgBPA對(duì)VTG的誘導(dǎo)效應(yīng)相似，BPA對(duì)VTG的誘導(dǎo)沒(méi)有表現(xiàn)明顯的劑量一依賴效應(yīng)。50mg/kgBPA的效應(yīng)與50mg/kgNP效應(yīng)接近。 時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明，NP和BPA對(duì)受試蝦的VTG表達(dá)水平有持續(xù)性誘導(dǎo)。150mg/kgNP作用下，

10、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VTG表達(dá)水平都高于對(duì)照組。第四天VTG表達(dá)水平達(dá)到第一個(gè)峰值，之后有下降趨勢(shì)，到第八天達(dá)到第二個(gè)峰值，但低于第一個(gè)峰值，之后直到第12天，VTG表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，且都高于對(duì)照組VTG水平；在100mg/kgBPA作用下，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VTG表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且除第7天與150mg/kgNP的誘導(dǎo)效應(yīng)接近外，其余各時(shí)間點(diǎn)VTG表達(dá)水平均低于150mg/kgNP的誘導(dǎo)效應(yīng)。100mg/kgBPA作用下，VTG表達(dá)水平在第4天出

11、現(xiàn)第一個(gè)峰值，之后呈下降趨勢(shì)，第7天出現(xiàn)第二個(gè)峰值，且略高于第一個(gè)峰值，之后又呈下降趨勢(shì)，第12天VTG表達(dá)水平略有上升。 這與NP和BPA對(duì)很多脊椎動(dòng)物的雌激素效應(yīng)研究結(jié)果相類似，也說(shuō)明了跟很多脊椎動(dòng)物一樣，VTG可以作為羅氏沼蝦EDC研究的一個(gè)生物標(biāo)志物。 4.壬基酚和雌二醇干擾羅氏沼蝦卵黃蛋白原VTG基因表達(dá)的效應(yīng) 采取孵化后雌性親蝦，NP和E<,2>浸泡處理，給藥濃度分別為：NP Ⅰ 100 μg/L和N

12、P Ⅱ 0.01 μg/L；E<,2>Ⅰ l μg/L和E<,2>Ⅱ 0.01 u g/L，于第3 d和第5 d取蝦卵巢和肝胰腺，對(duì)VTG基因表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果表明，肝胰腺中，NP Ⅰ(100 μg/L)處理后，3 d內(nèi)VTG表達(dá)量上升，處理5 d后VTG表達(dá)量與對(duì)照組比較差異不明顯；NP Ⅱ(0.01μ g/L)處理后，VTG表達(dá)量無(wú)明顯變化；E<,2>Ⅰ(1 μg/L)處理后， VTG基因表達(dá)在3 d和5 d內(nèi)與

13、對(duì)照組比較，表達(dá)量明顯上升；E<,2>Ⅱ(0.01 μg/L)處理后，3 d內(nèi)VTG表達(dá)量上升，但明顯低于E<,2>Ⅰ(1μg/L)3 d和5 d誘導(dǎo)效應(yīng)，E<,2>Ⅱ(0.01 μg/L)處理5 d后VTG表達(dá)量有下降，但仍高于對(duì)照組表達(dá)量。 卵巢中，經(jīng)NP Ⅰ(100μg/L)處理后，3 d和5 d內(nèi)VTG表達(dá)均上升且水平差異不大；經(jīng)NP Ⅱ(0.01μg/L)處理后，3 d后表達(dá)量上升，5 d后回落，略高于對(duì)照組水平；經(jīng)E

14、<,2>Ⅰ(1μg/L)處理后，卵巢中VTG基因表達(dá)在3 d和5 d內(nèi)與對(duì)照組比較，均有明顯上升，5 d后的表達(dá)量比3 d后的表達(dá)量有所降低；經(jīng)E<,2>Ⅱ(0.01μg/L)處理后，3 d內(nèi)卵巢中VTG表達(dá)比對(duì)照組表達(dá)量高，5 d后表達(dá)量有下降，略高于對(duì)照組。 羅氏沼蝦表現(xiàn)出對(duì)NP濃度有一定的劑量依賴關(guān)系，且1 μg/L和0.01 μg/L E<,2>均表現(xiàn)了較強(qiáng)的雌激素效應(yīng)，雌激素活性E<,2>>NP。這可能由于E<,2>是