柑橘全爪螨不同品系轉(zhuǎn)錄組及基因表達譜差異分析.pdf

1、柑橘全爪螨是世界性柑橘害螨,對產(chǎn)量影響極大,同時也是常見哮喘和鼻炎的過敏源。柑橘全爪螨為多食性害螨,可取食柑橘,玫瑰,杏,梨,蓖麻等80余種植物。該螨由于歷期短,世代多,繁殖力強,因而極易對殺螨劑產(chǎn)生抗性,目前已報道對絕大多數(shù)登記的殺螨劑產(chǎn)生不同程度的抗性?；蚪M信息極其匱乏嚴重阻礙了柑橘全爪螨抗性機理的深入研究。為了從分子水平上弄清其抗性機理,作者應(yīng)用了新一代測序技術(shù)(IlluminaHiSeqTM2000)測定了柑橘全爪螨抗性品系和

2、敏感品系轉(zhuǎn)錄組,在此基礎(chǔ)上,運用數(shù)字基因表達譜技術(shù)比較了抗性品系和敏感品系基因表達差異。
　　 1、柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系篩選
　　 柑橘全爪螨采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所多年未施藥的枳橙苗上,經(jīng)室內(nèi)不接觸藥劑連續(xù)飼養(yǎng)3年視為敏感品系(LC50為0.056μg/ml)。敏感品系用噻螨酮進行抗性篩選(選擇壓力為70%左右).經(jīng)過20代連續(xù)汰選,獲得抗性倍數(shù)為3532.12的噻螨酮抗性品系(LC50為197.799μg/m

3、l).
　　 2、柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)組裝
　　 通過轉(zhuǎn)錄組測序,從柑橘全爪螨抗性品系和敏感品系分別獲得了25,000,000和26,000,000個平均長度為90bp的凈Reads。使用SOAPdenovo軟件進行初步組裝,在抗性品系中得到215,641條平均長度為178bp的contigs,在敏感品系中得到282,291條平均長度為151bp的contigs。利用成對Reads的拼接與填空,在抗性品系和敏感品系分別得

4、到了38,178條平均長度為453bp的scaffolds和44,017條平均長度為406bp的scaffolds。Scaffolds進一步組裝后,在抗性和敏感株系分別得到30,466條平均長度為536bp的Unigene和34,159條平均長度為489bp的Unigene。利用同樣的方法,將混合reads組裝成32217條Unigene。我們把混合Reads比對到nr,COG,KEGGE,GO數(shù)據(jù)庫中,共有17581條基因得到了功能注

5、釋且E值小于等于le-5,其中有7075條基因的到COG注釋,12712條基因得到KEGG的注釋,3812條基因得到GO注釋,17457條基因得到nr注釋。
　　 3、常規(guī)殺蟲劑抗性有關(guān)基因的簽定及差異分析
　　 從組裝的Unigene中鑒定出200條與常規(guī)殺蟲劑代謝抗性相關(guān)的基因,包括121條P450基因,30條谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因,43條羧酸酯酶基因,2條NADA脫氫酶基因和4條超氧化物歧化酶基因。根據(jù)P450相似性

6、,對46條P450基因進行差異性分析(E值＜10-5)?；贚og2ration值,發(fā)現(xiàn)有9條P450基因,4條GST基因,3條羧酸酯酶基因和l條酯酶基因表達倍數(shù)差異大于2。表達倍數(shù)大于2的4條P450基因?qū)儆诜种?且參與外源物質(zhì)代謝通路(k000982和k000980),另外有1條上調(diào)的GST基因也參與外源物質(zhì)代謝通路(k000980)。
　　 4、柑橘全爪螨不同品系生長發(fā)育相關(guān)基因及常規(guī)靶標基因的比較
　　 基于噻螨

7、酮作用機理,從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄本中鑒定出105條與生長有關(guān)的基因,194條與生殖有關(guān)的基因。通過比較敏感和抗性品系的鈉離子通道、GABA受體和生長發(fā)育相關(guān)基因的核酸序列,分別獲得了24,12和23個SNPs。這些SNPs主要集中在G.A,T-C,C-T三種類型。
　　 5、柑橘全爪螨不同品系基因表達譜分析
　　 進一步通過測序和比較尼索朗抗性和敏感品系數(shù)字基因表達譜,得到了148條差異倍數(shù)大于2的基因和246條差異倍數(shù)大于

8、1的基因。顯著性分析表明有65條基因得到了GO富集分析,22條基因得到了Pathway富集分析。在這些顯著差異表達基因中,發(fā)現(xiàn)Unigene21272_All,Unigene23131_All,Unigene25542_All共3個上調(diào)表達倍數(shù)最大的新轉(zhuǎn)錄本,他們的表達倍數(shù)依次為15.47,14.50,13.78。
　　 據(jù)筆者所知,本研究是首次應(yīng)用比較轉(zhuǎn)錄組的方法鑒定可能的螨類抗藥性基因。通過比較分析,鑒定比較了與常規(guī)殺蟲劑有