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文檔簡(jiǎn)介
1、柑橘全爪螨是世界性柑橘害螨,對(duì)產(chǎn)量影響極大,同時(shí)也是常見(jiàn)哮喘和鼻炎的過(guò)敏源。柑橘全爪螨為多食性害螨,可取食柑橘,玫瑰,杏,梨,蓖麻等80余種植物。該螨由于歷期短,世代多,繁殖力強(qiáng),因而極易對(duì)殺螨劑產(chǎn)生抗性,目前已報(bào)道對(duì)絕大多數(shù)登記的殺螨劑產(chǎn)生不同程度的抗性?;蚪M信息極其匱乏嚴(yán)重阻礙了柑橘全爪螨抗性機(jī)理的深入研究。為了從分子水平上弄清其抗性機(jī)理,作者應(yīng)用了新一代測(cè)序技術(shù)(IlluminaHiSeqTM2000)測(cè)定了柑橘全爪螨抗性品系和
2、敏感品系轉(zhuǎn)錄組,在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)比較了抗性品系和敏感品系基因表達(dá)差異。
1、柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系篩選
柑橘全爪螨采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所多年未施藥的枳橙苗上,經(jīng)室內(nèi)不接觸藥劑連續(xù)飼養(yǎng)3年視為敏感品系(LC50為0.056μg/ml)。敏感品系用噻螨酮進(jìn)行抗性篩選(選擇壓力為70%左右).經(jīng)過(guò)20代連續(xù)汰選,獲得抗性倍數(shù)為3532.12的噻螨酮抗性品系(LC50為197.799μg/m
3、l).
2、柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)組裝
通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,從柑橘全爪螨抗性品系和敏感品系分別獲得了25,000,000和26,000,000個(gè)平均長(zhǎng)度為90bp的凈Reads。使用SOAPdenovo軟件進(jìn)行初步組裝,在抗性品系中得到215,641條平均長(zhǎng)度為178bp的contigs,在敏感品系中得到282,291條平均長(zhǎng)度為151bp的contigs。利用成對(duì)Reads的拼接與填空,在抗性品系和敏感品系分別得
4、到了38,178條平均長(zhǎng)度為453bp的scaffolds和44,017條平均長(zhǎng)度為406bp的scaffolds。Scaffolds進(jìn)一步組裝后,在抗性和敏感株系分別得到30,466條平均長(zhǎng)度為536bp的Unigene和34,159條平均長(zhǎng)度為489bp的Unigene。利用同樣的方法,將混合reads組裝成32217條Unigene。我們把混合Reads比對(duì)到nr,COG,KEGGE,GO數(shù)據(jù)庫(kù)中,共有17581條基因得到了功能注
5、釋且E值小于等于le-5,其中有7075條基因的到COG注釋,12712條基因得到KEGG的注釋,3812條基因得到GO注釋,17457條基因得到nr注釋。
3、常規(guī)殺蟲(chóng)劑抗性有關(guān)基因的簽定及差異分析
從組裝的Unigene中鑒定出200條與常規(guī)殺蟲(chóng)劑代謝抗性相關(guān)的基因,包括121條P450基因,30條谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因,43條羧酸酯酶基因,2條NADA脫氫酶基因和4條超氧化物歧化酶基因。根據(jù)P450相似性
6、,對(duì)46條P450基因進(jìn)行差異性分析(E值<10-5)?;贚og2ration值,發(fā)現(xiàn)有9條P450基因,4條GST基因,3條羧酸酯酶基因和l條酯酶基因表達(dá)倍數(shù)差異大于2。表達(dá)倍數(shù)大于2的4條P450基因?qū)儆诜种?且參與外源物質(zhì)代謝通路(k000982和k000980),另外有1條上調(diào)的GST基因也參與外源物質(zhì)代謝通路(k000980)。
4、柑橘全爪螨不同品系生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因及常規(guī)靶標(biāo)基因的比較
基于噻螨
7、酮作用機(jī)理,從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄本中鑒定出105條與生長(zhǎng)有關(guān)的基因,194條與生殖有關(guān)的基因。通過(guò)比較敏感和抗性品系的鈉離子通道、GABA受體和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的核酸序列,分別獲得了24,12和23個(gè)SNPs。這些SNPs主要集中在G.A,T-C,C-T三種類型。
5、柑橘全爪螨不同品系基因表達(dá)譜分析
進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序和比較尼索朗抗性和敏感品系數(shù)字基因表達(dá)譜,得到了148條差異倍數(shù)大于2的基因和246條差異倍數(shù)大于
8、1的基因。顯著性分析表明有65條基因得到了GO富集分析,22條基因得到了Pathway富集分析。在這些顯著差異表達(dá)基因中,發(fā)現(xiàn)Unigene21272_All,Unigene23131_All,Unigene25542_All共3個(gè)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最大的新轉(zhuǎn)錄本,他們的表達(dá)倍數(shù)依次為15.47,14.50,13.78。
據(jù)筆者所知,本研究是首次應(yīng)用比較轉(zhuǎn)錄組的方法鑒定可能的螨類抗藥性基因。通過(guò)比較分析,鑒定比較了與常規(guī)殺蟲(chóng)劑有
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