徐淮山羊H-FABP基因克隆及轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因羊的制備.pdf

1、脂肪酸結(jié)合蛋白家族(FattyAcid-Bindingproteins，F(xiàn)ABPs)是一類小分子量蛋白，大小約為12-16KDa，該蛋白家族屬于載脂蛋白超家族(Lipocalinsuperfamily)，是一類脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。該蛋白家族最早是1971年美國(guó)加州大學(xué)的Ocker等在研究大鼠的脂肪酸吸收的調(diào)節(jié)時(shí)，在小腸腸粘膜發(fā)現(xiàn)。到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)十一種亞型，根據(jù)其主要分布器官和組織不同，主要分為:腸型(Intestinal，I-FABP)

2、、心臟型(Heart，H-FABP)、肝臟型(Liver，L-FABP)、脂肪細(xì)胞型(Adipocyte，A-FABP)、腦型(BrainFABP)、表皮型(EpidermalFABP)、回腸型(IlealFABP)、髓磷脂型(MyelinFABP)、腎型(RenalFABP)、睪丸型(testisFABP，T-FABP)脂肪酸結(jié)合蛋白以及細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白(CellRetinoidBindingProtein，CRBP)和細(xì)胞視黃醇酸

3、結(jié)合蛋白(CellRetinoidAcidBindingProtein，CRABP)。不同的亞型之間具有較強(qiáng)的同源性。該蛋白家族占細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白總量的3％-8％。主要參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，可將脂肪酸從細(xì)胞膜上運(yùn)送到甘油三酯和磷脂合成的位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂肪酸代謝。
　　 心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heartfattyacidbindingprotein，H-FABP)在脂肪酸結(jié)合蛋白家族中分布最廣泛，作用也最為重要。它主要存在于3種

4、細(xì)胞之中:(1)β氧化速率高的細(xì)胞（如心肌、骨骼肌細(xì)胞）;(2)脂肪代謝強(qiáng)度高、尤其是類固醇合成旺盛的細(xì)胞（如內(nèi)分泌系統(tǒng)的腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、泌乳的乳腺）;(3)內(nèi)胚層起源的細(xì)胞。在心肌中含量最為豐富，約占心臟全部可溶性蛋白的4％-8％。其主要作用是防止細(xì)胞內(nèi)堆積游離脂肪酸。該蛋白是一種可溶性細(xì)胞質(zhì)蛋白，分子量為14-15KDa。H-FABP是一種酸性蛋白質(zhì)，在不同的物種之間具有較強(qiáng)的保守性。人H-FABP的一級(jí)結(jié)構(gòu)由132個(gè)氨基酸殘基組成

5、，牛、羊、野豬、小家鼠等H-FABP的一級(jí)結(jié)構(gòu)由133個(gè)氨基酸殘基組成。本研究克隆出徐淮山羊H-FABP基因CDS，并針對(duì)其進(jìn)行一系列分析。結(jié)果顯示:徐淮山羊H-FABP基因CDS共有402bp，編碼133個(gè)氨基酸，蛋白分子量大小為14.76kDa，等電點(diǎn)為6.369，是一種酸性蛋白。徐淮山羊H-FABP基因序列和氨基酸序列與根據(jù)GenBank上報(bào)道的人、雞、褐家鼠、奶牛，野豬、驢及斑馬魚進(jìn)行同源性比較，可知該基因在不同的物種之間具有較

6、高的保守性。該蛋白無(wú)信號(hào)肽，無(wú)糖基化位點(diǎn)，但是存在8個(gè)磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)GFP示綜蛋白和間接免疫熒光雙重檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)徐淮山羊H-FABP蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
　　 通過(guò)睪丸注射法，將攜帶有徐淮山羊H-FABP的重組載體轉(zhuǎn)入雄性小鼠睪丸內(nèi)，然后將雄鼠和空懷母鼠合籠，獲得G0代小鼠，經(jīng)過(guò)DNA和蛋白水平檢測(cè)，最終獲得4％(7/175)的陽(yáng)性個(gè)體。將G0代陽(yáng)性個(gè)體自交獲得G1代小鼠，經(jīng)過(guò)DNA和蛋白水平檢測(cè)，最終獲得30.23％(13

7、/43)的陽(yáng)性的陽(yáng)性個(gè)體。將G0和G1陽(yáng)性個(gè)體采集心肌、腿肌和背最長(zhǎng)肌，并測(cè)定其肌間脂肪含量，結(jié)果顯示陽(yáng)性個(gè)體較陰性個(gè)體肌間脂肪含量顯著偏高。結(jié)果說(shuō)明:外源基因的生物學(xué)功能在小鼠水平得到充分發(fā)揮。
　　 利用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因羊，將徐淮山羊H-FABP基因轉(zhuǎn)入波爾山羊成纖維細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)G418獲得陽(yáng)性細(xì)胞系。將陽(yáng)性細(xì)胞作為核供體注射入成熟去核卵母細(xì)胞中，再將重組胚胎植入受體母羊子宮中，并獲得4例陽(yáng)性流產(chǎn)胎兒和一只活體陽(yáng)性羔羊，