蚓激酶基因在山羊乳腺中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因小鼠的制備.pdf

1、蚓激酶(Lumbrokinase)是從蚯蚓中提取的具有纖溶和溶栓活性的多酶組分。1991年由Mihara等首次分離并命名。目前已有多種蚓激酶制劑，其商品名為普恩復(fù)、百奧、博洛克及溶栓膠囊等，主要用于缺血性腦病、冠心病和心肌梗死等心腦血管疾病的治療。最近Fan等發(fā)現(xiàn)蚓激酶的一種組分(EFE-Ⅲ-1)可透過小腸上皮吸收并在循環(huán)系統(tǒng)中保持其生物學(xué)活性，表明蚓激酶具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價(jià)值。到目前為止，雖然蚓激酶基因已被克隆，但并沒有表達(dá)出具有

2、活性的蚓激酶蛋白的報(bào)道。實(shí)現(xiàn)蚓激酶的表達(dá)進(jìn)而通過制備乳腺生物反應(yīng)器大量獲得表達(dá)產(chǎn)物，對于蚓激酶的研究及產(chǎn)品的開發(fā)有重要意義。 動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器(Mammaryglandbioreactor)技術(shù)屬于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)具體應(yīng)用的一個(gè)方面，是指利用哺乳動(dòng)物乳腺特異性表達(dá)的啟動(dòng)子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，指導(dǎo)外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺中表達(dá)，并從動(dòng)物的乳汁中獲取重組蛋白。1987年，Gordon等首先從轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中獲得了人類tPA蛋白。

3、此后的研究證實(shí)，動(dòng)物乳腺具有廣泛表達(dá)外源基因的能力，一些在臨床上有重要應(yīng)用的蛋白類藥物如α-1-抗胰蛋白酶、tPA、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白及蛋白C等相繼在動(dòng)物乳腺中得以表達(dá)，其中一些表達(dá)產(chǎn)物已進(jìn)入了臨床應(yīng)用。制備乳腺生物反應(yīng)器的方法與制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)一致，有顯微注射技術(shù)、精子載體技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術(shù)及體細(xì)胞核移植等。其中主要使用的是顯微注射技術(shù)。顯微注射技術(shù)存在著成本高、周期長、轉(zhuǎn)基因效率低及目的基因隨機(jī)整合等不足。體細(xì)胞核移植方法雖然代表

4、了制備乳腺生物反應(yīng)器的趨勢，但對實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)室整體研究水平的要求較高，很多實(shí)驗(yàn)室不具備這樣的條件。目前已有利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染制備乳腺生物反應(yīng)器的方法，此方法對實(shí)驗(yàn)條件的要求相對較低，同時(shí)實(shí)驗(yàn)成本不高，有可能成為一種較為實(shí)用的方法。本實(shí)驗(yàn)對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法進(jìn)行了嘗試，在目的基因的選擇上使用人工合成的蚓激酶基因。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)蚓激酶基因可以在山羊乳腺中暫時(shí)表達(dá)，這在一定程度上可以反映目的基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)期望通過

5、制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒并利用重組病毒感染乳腺細(xì)胞的方法實(shí)現(xiàn)蚓激酶基因在山羊乳腺的表達(dá)。 為了減少培育轉(zhuǎn)基因大家畜的盲目性，在建立大家畜乳腺生物反應(yīng)器之前，都要對所用目的基因的表達(dá)性能進(jìn)行鑒定。目前，鑒定和篩選乳腺表達(dá)載體的方法主要有三種：乳腺細(xì)胞表達(dá)法、動(dòng)物乳腺暫時(shí)表達(dá)法及制備轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺生物反應(yīng)器模型。乳腺細(xì)胞表達(dá)法雖然簡便、客觀，但不能完全反映動(dòng)物在生理?xiàng)l件下的真實(shí)情況。動(dòng)物乳腺暫時(shí)表達(dá)法操作簡便，能部分反映動(dòng)物在生理?xiàng)l件下的

6、表達(dá)情況，但仍存在表達(dá)時(shí)間短、表達(dá)量與注射劑量有關(guān)等不足，通常用于對所構(gòu)建的乳腺表達(dá)載體的表達(dá)效率進(jìn)行初步的評(píng)估。制備轉(zhuǎn)基因小鼠雖然周期較長且成本較高，有時(shí)也不能完全反映制備的轉(zhuǎn)基因大家畜的表達(dá)情況，但由于小鼠的繁殖周期短，產(chǎn)仔率高，可在整體水平上研究目的基因的表達(dá)情況，因此制備轉(zhuǎn)基因小鼠仍是評(píng)估乳腺表達(dá)載體所普遍采用的方法。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)現(xiàn)了蚓激酶基因暫時(shí)表達(dá)的基礎(chǔ)上，采用常規(guī)的顯微注射技術(shù)制備蚓激酶轉(zhuǎn)基因小鼠，為下一步制備蚓激酶轉(zhuǎn)基因大

7、家畜的工作打下了基礎(chǔ)。 材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純種波爾山羊及昆明種小白鼠。 1.2菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株E.coliDH5α為本室保存。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3，Invitrogen公司。載體pGEMT-bCP，含有山羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子；載體pMD18T-LK，含有人工合成的蚓激酶基因cDNA；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNC-LacZ，均為前期工作所構(gòu)建并保存。PA317和NIH3T3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

8、 1.3蚓激酶基因在山羊乳腺的暫時(shí)表達(dá)1.3.1構(gòu)建包含山羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子及人工合成蚓激酶基因cDNA的乳腺表達(dá)載體并使用堿裂解法大量制備。 1.3.2通過直接注射將載體DNA導(dǎo)入泌乳期山羊乳腺。 1.3.3使用纖維蛋白平板法檢測乳汁中蚓激酶表達(dá)產(chǎn)物的活性。 1.4重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的蚓激酶基因在山羊乳腺的表達(dá)1.4.1構(gòu)建包含山羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子及人工合成蚓激酶基因cDNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載

9、體。 1.4.2利用PA317細(xì)胞包裝所構(gòu)建的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 1.4.3使用PCR技術(shù)鑒定克隆細(xì)胞株中目的基因的整合。 1.4.4在NIH3T3細(xì)胞上測定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度。 1.4.5通過直接注射將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入臨產(chǎn)前山羊乳腺。 1.4.6使用纖維蛋白平板法檢測乳汁中蚓激酶表達(dá)產(chǎn)物的活性。 1.5蚓激酶轉(zhuǎn)基因小鼠的制備 1.5.1制備顯微注射用DNA。 1.5

10、.2利用常規(guī)顯微注射技術(shù)制備蚓激酶轉(zhuǎn)基因小鼠。 1.5.3通過PCR及Southern雜交鑒定蚓激酶轉(zhuǎn)基因鼠及其后代。 1.5.4使用纖維蛋白平板法檢測轉(zhuǎn)基因鼠乳汁中蚓激酶表達(dá)產(chǎn)物的活性。 結(jié)果2.1蚓激酶基因在山羊乳腺的暫時(shí)表達(dá)結(jié)果構(gòu)建了包含山羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子和蚓激酶基因cDNA的乳腺表達(dá)載體pBLK。通過直接注射將其導(dǎo)人山羊的乳腺組織并檢測乳汁中蚓激酶表達(dá)產(chǎn)物的活性。結(jié)果顯示蚓激酶基因可以在山羊乳腺中暫

11、時(shí)表達(dá)。注射后6-9h的表達(dá)量最高，達(dá)到2.0×105U/L，并持續(xù)表達(dá)至60h。重復(fù)注射對表達(dá)結(jié)果無影響。 2.2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的蚓激酶基因在山羊乳腺的表達(dá)結(jié)果構(gòu)建了包含山羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子及人工合成蚓激酶基因cDNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNBLK。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PA317，經(jīng)G418加壓篩選，獲得產(chǎn)毒細(xì)胞克隆。PCR鑒定證實(shí)目的基因已整合入產(chǎn)毒細(xì)胞基因組。在NIH3T3細(xì)胞上測定

12、的重組病毒滴度為2×104～1×105CFU/ml。將產(chǎn)毒細(xì)胞上清直接注入臨產(chǎn)前山羊的乳腺組織，待產(chǎn)羔后采集乳汁并測定蚓激酶表達(dá)產(chǎn)物的活性，結(jié)果表明乳汁中有蚓激酶的表達(dá)，且產(chǎn)羔后第45日，乳汁中表達(dá)產(chǎn)物的纖溶活性無明顯下降。 2.3蚓激酶轉(zhuǎn)基因小鼠的制備結(jié)果使用SalⅠ和PvuⅡ酶切乳腺表達(dá)載體pBLK，得到含有全部表達(dá)盒的DNA片段，采用常規(guī)顯微注射技術(shù)將其導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核。共注射800枚卵，將注射后存活的約500枚卵移

13、植到29只假孕母鼠輸卵管內(nèi)，其中11只母鼠懷孕，產(chǎn)仔43只。經(jīng)PCR及Southern雜交鑒定，3只為轉(zhuǎn)基因小鼠。將存活的2只轉(zhuǎn)基因小鼠與正常小鼠交配，所生仔鼠中均檢測出轉(zhuǎn)基因后代，表明轉(zhuǎn)入的目的基因能正常傳代。使用纖維蛋白平板法檢測轉(zhuǎn)基因鼠乳汁中目的基因的表達(dá)情況，未測定出蚓激酶的活性。 結(jié)論3.1構(gòu)建了蚓激酶乳腺表達(dá)載體，通過直接注射將載體導(dǎo)入泌乳期山羊乳腺，實(shí)現(xiàn)了蚓激酶基因在山羊乳腺的暫時(shí)表達(dá)。 3.2構(gòu)建了蚓激酶