野莧菜凝集素基因的克隆及轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、蚜蟲屬同翅目昆蟲，種類繁多，侵害目標(biāo)廣泛。它通過口器深入植物的韌皮部吸收營養(yǎng)，并攜帶和傳播病毒，造成農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。植物抗蟲基因工程為控制害蟲的危害提供了新的途徑。利用MARs序列(Matrix attachment regios，MARs)是在染色體水平克服外源基因失活的一種有效策略。本研究采用同源擴(kuò)增PCR技術(shù)，從莧屬的野莧菜中分離和克隆新的莧菜凝集素家族基因，并對這個(gè)基因的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究，闡明在現(xiàn)代分子遺傳育種中引入

2、該基因的可能途徑和重要意義。通過構(gòu)建殺蟲融合蛋白基因，即將兩個(gè)抗蟲基因編碼序列通過接頭連接在一起，構(gòu)成可同時(shí)表達(dá)兩種抗蟲活性的融合蛋白，以期能延緩昆蟲抗性的發(fā)生，而且也增強(qiáng)了殺蟲活性。另外，在減少基因沉默的措施上，在目的基因的兩側(cè)增加基質(zhì)結(jié)合序列(MARs)，以增強(qiáng)基因的表達(dá)能力。本研究取得的主要結(jié)果如下： 1.利用同源克隆的方法從野莧菜Amaranthus viridis L.中克隆到野莧菜凝集素基因(Amaranthus v

3、iridis aggllutinin，AVA)。轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗蚜分析表明，表達(dá)野莧菜凝集素的轉(zhuǎn)基因煙草植株都不同程度地抑制了蚜蟲群體發(fā)展的速度，轉(zhuǎn)AVA和AVAc基因植株平均抑蚜率分別約為60.81％和50.63％。轉(zhuǎn)含有內(nèi)含子的AVA基因比不含內(nèi)含子的編碼區(qū)基因AVAc有更好的抗蚜性。AVA基因是莧菜凝集素基因家族的新成員，是一個(gè)有應(yīng)用前景的新的抗蟲基因。 2.本研究從三個(gè)不同品種的豌豆中分離到3個(gè)具有MARs序列特征的D

4、NA片段MMAR，DMAR，HMAR。利用GenBank同源性搜尋發(fā)現(xiàn)它們是新的未注冊的DNA序列。經(jīng)轉(zhuǎn)化煙草對GUS活性測定發(fā)現(xiàn)，兩側(cè)順式重復(fù)連接MAR對外源基因表達(dá)的增強(qiáng)作用很明顯，MMAR、HMAR和DMAR都不同程度的提高了GUS的表達(dá)，分別為載體對照植株的4.16、3.66和2.08倍。但不同個(gè)體間表達(dá)水平差異仍然比較明顯。 3.通過構(gòu)建MAR-AVA-MAR植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化白菜，獲得抗蚜轉(zhuǎn)化植株。含

5、有AVA基因的白菜植株對桃蚜的群體發(fā)展有一定的抑制作用，在接種12天后的平均抑制桃蚜密度達(dá)55.8％；在轉(zhuǎn)基因抗性植株上觀察到有少量桃蚜若蟲死亡的現(xiàn)象。無MAR的轉(zhuǎn)基因植株平均桃蚜抑制率為34.3％。但含MAR的轉(zhuǎn)基因單株之間基因表達(dá)也仍存在一定的差異。從總體上來說含有MAR的轉(zhuǎn)基因白菜植株較不含MAR的轉(zhuǎn)化植株對桃蚜具有更明顯的抑制作用，且抗性程度與AVA基因的表達(dá)量呈正相關(guān)。 4.根據(jù)豇豆胰蛋白酶抑制劑CpT1和野莧菜凝集素