轉(zhuǎn)基因羊外源基因甲基化及納米載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,目前在許多物種上都成功獲得了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,但外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)效率依然是轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的障礙之一。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式,調(diào)節(jié)著機(jī)體的許多生物學(xué)過程。發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化修飾通常參與該基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)調(diào)控。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中,外源基因及其啟動(dòng)子的甲基化都可能影響著外源基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中通過體細(xì)胞克隆,干細(xì)胞克隆和卵周隙注射法分別獲得轉(zhuǎn)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced

2、green fluorescent protein, eGFP)、成纖維細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)因子5(fibroblast growth factor5,FGF5)的轉(zhuǎn)基因綿羊。本研究通過檢測(cè)外源基因 eGFP、FGF5編碼區(qū)及其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平,并對(duì)外源蛋白表達(dá)效率進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明,干細(xì)胞克隆外源基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平最高,其次是體細(xì)胞克隆,卵周隙注射法最低;而對(duì)于編碼區(qū)的甲基化水平則隨外源基因不同而存在差異,外源基因eGFP編碼區(qū)

3、的甲基化水平在卵周隙注射法中最高,其次是干細(xì)胞克隆;但外源基因FGF5編碼區(qū)甲基化水平卻在體細(xì)胞克隆最高。Western blot檢測(cè)外源基因的蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)外源基因蛋白的表達(dá)量同其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平呈負(fù)相關(guān)性。結(jié)果提示不同的轉(zhuǎn)基因方法可能會(huì)影響外源基因的甲基化水平,從而影響到外源基因的表達(dá)。
　　納米材料可使吸附目的基因形成納米基因復(fù)合物,通過內(nèi)吞或吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),屬于非病毒型基因載體系統(tǒng),具有易于制備和安全性高等特

4、點(diǎn)。本研究利用納米材料作為載體探索轉(zhuǎn)基因技術(shù)。首先克隆獲得綿羊細(xì)胞重編程因子SOX2的cDNA序列并構(gòu)建表達(dá)載體pLEX-SOX2-GFP。利用MgCl2、AlCl3、NaOH三種化合物制備直徑約100 nm呈六邊形雙層片狀結(jié)構(gòu)的Mg2Al-Cl-LDH納米顆粒。以納米顆粒 Mg2Al-Cl-LDH結(jié)合pLEX-SOX2-GFP轉(zhuǎn)染HEK293T,流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP熒光信號(hào)評(píng)估轉(zhuǎn)染效果。優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件是:質(zhì)粒DNA與LDH共孵育的時(shí)

5、間在15min是轉(zhuǎn)染效率最高(6.93％);質(zhì)粒DNA與LDH的質(zhì)量比為4:50時(shí)轉(zhuǎn)染率最高(11.17%)。納米材料濃度與轉(zhuǎn)染效率呈正比,但同細(xì)胞的存活率呈反比,在200μg/ml為最佳濃度,細(xì)胞存活率最高(87%),轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)時(shí)間24h時(shí)轉(zhuǎn)染率最好(17.4%)。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)均有明顯的綠色熒光蛋白的表達(dá),說明該轉(zhuǎn)染方法可靠,表達(dá)能力強(qiáng)。
　　總之,本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因蛋白的表達(dá)量同其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平呈負(fù)相