克隆徐淮山羊SCD1基因及轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因綿羊的制備.pdf

1、硬脂酰輔酶A脫氫酶(Stearoyl-CoAdesaturase，SCD)是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白酶，是一種微粒體蛋白酶，屬于脫氫酶家族。哺乳動物SCD基因的cDNA首次在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)，在小鼠中SCD存在4種異構(gòu)體，分別是SCD1～SCD4，它們分別編碼355、358、359和352個氨基酸。在正常的飲食條件下，SCD1 mRNA在白色脂肪組織、褐色脂肪組織、瞼板腺、哈德腺和包皮腺中高度表達(dá)，并且在肝臟和心臟中可被高碳水化合物顯著

2、誘導(dǎo)。
　　SCD1是脂肪代謝中的重要酶，是催化由飽和脂肪酸(SFA)合成不飽和脂肪酸(MUFA)的限速酶，在脂肪酸生物合成中起著中心調(diào)節(jié)作用。脂類中飽和脂肪酸(SFAs)與不飽和脂肪酸(MUFAs)的比例影響脂蛋白代謝、生物膜流動性和信號傳導(dǎo)，進(jìn)而與糖尿病、動脈粥樣硬化、癌癥、肥胖癥等多種疾病相關(guān)，因此SCD1在近年成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，SCD1可能影響奶中SFAs/MUFAs比率、肌間脂肪沉積和成分，是改善乳品品質(zhì)和肌肉質(zhì)量

3、的主要候選基因。肌間脂肪中不飽和脂肪酸含量的提高對于肉品質(zhì)和肉風(fēng)味的改善也有著重要影響，而且不飽和脂肪酸與人類健康也有密切的關(guān)系。本研究克隆出徐淮山羊SCD1基因CDS并對其進(jìn)行了生物學(xué)信息分析，進(jìn)行體外表達(dá)、亞細(xì)胞定位研究，最后通過睪丸注射法介導(dǎo)SCD1基因制備轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因綿羊。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.克隆SCD1基因、生物學(xué)信息分析及構(gòu)建真核重組表達(dá)載體。設(shè)計擴(kuò)增SCD1基因特異引物，采用RT-PCR方法從徐淮山羊脂

4、肪組織中克隆出SCD1基因cDNA。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體中，測序與酶切結(jié)果表明pMD19-T-SCD1構(gòu)建正確。將SCD1基因克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-SCD1，酶切與測序結(jié)果均表明pEGFP-SCD1構(gòu)建正確。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:徐淮山羊SCD1基因CDS區(qū)共有1074bp，編碼357個氨基酸，蛋白分子量大小為41.35kDa，等電點(diǎn)為7.0，GenBank登錄號為JX85

5、4036。徐淮山羊SCD1基因序列和氨基酸序列與GenBank上報道的人、褐家鼠、小家鼠、綿羊、山羊、牛和野豬進(jìn)行同源性比較，可知該基因在不同物種之間有較高的保守性。
　　2.重組真核表達(dá)載體pEGFP-SCD1體外表達(dá)及其亞細(xì)胞定位研究。采用脂質(zhì)體重組融合表達(dá)載體pEGFP-SCD1轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，48h后在熒光倒置顯微鏡下直接觀察綠色熒光在細(xì)胞中的位置，并提取細(xì)胞總RNA。用軟件預(yù)測和RT-PCR方法鑒定該融合蛋白在細(xì)

6、胞中的表達(dá)情況。軟件預(yù)測結(jié)果顯示SCD1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。在倒置熒光顯微鏡下觀察，重組SCD1蛋白的熒光分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)無熒光;RT-PCR結(jié)果顯示重組表達(dá)載體在NIH-3T3細(xì)胞中得到表達(dá)。
　　3.制備攜帶SCD1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過睪丸注射法，將攜帶有徐淮山羊SCD1的重組載體轉(zhuǎn)入雄性小鼠睪丸內(nèi)，然后將雄鼠和空懷母鼠合籠，獲得F1代小鼠，經(jīng)過DNA和蛋白水平檢測，最終獲得6.67％的陽性個體。將F1代陽性個體