茶樹cDNA文庫的構建及新梢特異表達基因EST序列分析.pdf

1、茶樹是一種重要的經濟作物.茶葉是世界最流行的飲料之一,對人體有重要的生理保健作用.為了更好了解茶樹新梢表達基因,并篩選出感興趣的目的基因,該文構建了龍井43和安吉白茶等兩個品種的新梢cDNA文庫,并對龍井43文庫進行較高通亮通量的EST測序和生物信息學分析.該研究獲得的主要結果如下:1.以Trizol一步法從春茶新梢中提取總RNA,分離純化富含Poly A的mRNA,LD-PCR反轉錄合成雙鏈cDNA,以λTripEX2為載體,構建了龍

2、井43新梢cDNA文庫,.文庫的滴度分別為6.8×10<'5>pfu/mL和4×10<'5> pfu/mL,符合高質量文庫的要求,.文庫的重組率為98.05﹪和96.15﹪,且插入片段的長度在1.0-1.5kb左右,說明文庫是完整的、有效的.兩個文庫總克隆數(shù)分別為3.5×10<'5>個和2.1×10<'5>個,高于所需標準.2.為了獲得高質量的EST序列,利用原來λTriplEx2載體獲得的質粒,在pUCM-T載體上引入2個SfiI酶切

3、位點后,構建了一個新載體SFiI-pUC.用新載體構建一個用于測序的質粒文庫.3.從龍井43新梢cDNA質粒文庫中隨機選取4320個克隆進行測序,根據(jù)EST標準獲得長度大于200bp的有用序列為2963個,測序成功率為占總克隆的68.60﹪.通過DNATool軟件進行冗余度分析后去除的重復序列有863個,占總獲得序列的33.88﹪,獲得有效ESTs 1684個,其平均長度為478bp.4.所有有效序列與NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫比對,有36.

4、0﹪序列(607EST)序列顯示了與已知序列高度的同源性;而與蛋白質數(shù)據(jù)庫進行比對時有71.3﹪的序列(1200 EST)顯示了與已知序列的高度的同源性,并建立了茶樹新梢特異表達基因數(shù)據(jù)庫.5.有效序列BlastX分析表明,豐度較高的基因(表達頻率≥5)約有30個,約占總數(shù)的10﹪;中等豐度基因(表達頻率在2-5之間)約100個,占總數(shù)的30﹪;其余低豐度的基因約占60﹪.說明在茶樹新梢中基因大多數(shù)呈中低豐度表達.6.結合擬南芥功能基因

5、分類標準,把通過BlastX比對獲得茶樹新梢有功能描述基因(包括功能確定的及推測功能的)分為12類,即能量代謝相關基因(Energy),占功能基因總數(shù)的26.39﹪、蛋白質合成相關基因(Protein synthesis)占17.86﹪、細胞結構相關基因(Cellstructure)占10.71﹪、細胞抗性及防御相關基因(Disease and defence)占9.23﹪、代謝相關基因(Metabolism)占8.33﹪、信號轉導相關

6、基因(Cellular signaltransduction)占5.36﹪、細胞內運輸相關基因(Cellular transporters)占4.66﹪、轉錄相關基因(Transcription)占3.87﹪、細胞生長發(fā)育相關基因(Cell growth and division)占3.77﹪、次生代謝相關基因(Secondary metabolism)占3.47﹪、蛋白質降解相關基因(Protein destination and s