連作地黃cDNA消減文庫的構(gòu)建及其響應基因的篩選.pdf

1、地黃為我國著名的常用大宗藥材，因具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老及降血糖等多方面功效，被廣泛應用于醫(yī)療、保健、食品等領(lǐng)域，年需求量越來越大。然而，地黃生產(chǎn)上存在嚴重的連作障礙問題，每茬收獲后須隔8-10年方可再種，這嚴重制約著地黃的可持續(xù)發(fā)展，因此，緩解和消除地黃連作障礙效應成為了亟待解決的關(guān)鍵問題。
　　 前人雖然對地黃連作障礙問題進行了廣泛的研究，但由于其形成及發(fā)生的原因錯綜復雜，人們對引起地黃連作障礙效應的分子機制尚未深入研究

2、。為了更深入的研究地黃連作障礙效應的機制及其消減技術(shù)，本試驗在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，以“溫85.5”地黃品種為供試材料，首次構(gòu)建了連作地黃cDNA消減文庫，通過生物信息學分析，篩選了一些差異表達基因，并對這些差異基因時空表進行了研究和初步的功能分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.地黃cDNA消減文庫的構(gòu)建：分別提取正茬和重茬地黃的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成單鏈及雙鏈cDNA，充分酶切消化，分別獲得Driver cDNA和Tester

3、 cDNA，并分別與2種不同的接頭連接，再進行2次消減雜交和2次抑制性PCR擴增，將第2次PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞進行文庫擴增，文庫擴增后各得到近1000個陽性克隆，對其進行PCR鑒定，并保存插入片段長度分布在250～750 bp之間的陽性克隆的菌液。最終構(gòu)建得到了具有高消減效率的正、反向cDNA文庫。
　　 2.測序結(jié)果與生物信息學分析：隨機挑選正庫和反庫各300個陽性克隆進行測

4、序，經(jīng)BLAST進行序列間比對，正庫獲得241條unique序列，反庫獲得223條unique序列，兩庫間重復序列為9條。分析后正庫、反庫分別獲得232條、214條差異的EST序列。將得到的序列與NCBI中的相應數(shù)據(jù)庫進行功能分析。正庫、反庫中分別有200條、195條EST序列的基因在NCBI數(shù)據(jù)庫有功能注釋。
　　 蛋白質(zhì)直系同源簇(COG)數(shù)據(jù)庫進行比較，預測可能的功能。把通過比對獲得有功能描述基因(包括功能確定的及推測功能

5、的)分類，正庫中有16類，反庫中有15類，主要是以下基因：能量的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換相關(guān)基因，氨基酸的運輸和代謝相關(guān)基因，核苷酸的運輸和代謝，糖類(碳水化合物)的運輸和代謝相關(guān)基因，輔酶的運輸和代謝相關(guān)基因，脂質(zhì)化合物的運輸和代謝相關(guān)基因，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成相關(guān)基因，轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，復制、重組、修復，細胞壁、細胞膜的生物合成相關(guān)基因，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶相關(guān)基因，無機離子的運輸和代謝相關(guān)基因，信號轉(zhuǎn)導機制相關(guān)基因，核結(jié)構(gòu)和細胞骨架相

6、關(guān)基因，一般功能的預測相關(guān)基因和一些功能未知相關(guān)基因，
　　 3.相關(guān)基因的時空表達與顯著性分析：分別對正庫中篩選的5個基因(分別編碼鈣依賴性蛋白激酶、SAM合成酶、ACC氧酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、鈣蛋白酶)和反庫中篩選的5個基因(分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶、RNA復制酶、依賴于DNA的RNA聚合酶Ⅱa、細胞周期蛋白D、RNA結(jié)合蛋白)在地黃各個時期各個組織中的表達水平進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：反庫中的5個基因在重茬地黃中有較高的表達量

7、，在正茬地黃中幾乎無表達，每個時期幾乎都達到了顯著差異水平，且在塊根膨大期達到極顯著差異水平；而正庫中的5個基因在正茬地黃中均有較高表達，而在重茬中表達量下降或無表達，各時期各部位的表達量也均達顯著性差異水平，并在塊根伸長期與膨大期達極顯著差異水平。這一結(jié)果一方面驗證了我們前期構(gòu)建的正、反差異表達cDNA文庫的正確性，同時也初步顯示了10個基因在地黃連作障礙形成中可能發(fā)揮一定的功能。
　　 4.基因的相關(guān)功能分析：正庫中鈣依賴性

8、蛋白激酶、鈣蛋白酶主要參與鈣信號傳遞和蛋白質(zhì)分解，SAM合成酶和ACC氧化酶主要參與乙烯的合成，甲基轉(zhuǎn)移酶主要參與生理調(diào)控和染色質(zhì)修，這5個基因在重茬地黃中均顯著上調(diào)了。反庫中RNA復制酶、RNA聚合酶、依賴于DNA的RNA聚合酶Ⅱa這三種酶主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和植物抗病毒作用，細胞周期蛋白D主要參與細胞生長與分裂，而RNA結(jié)合蛋白主要參與基因的表達調(diào)控和抗逆反應，而這5個基因在重茬地黃中均被下調(diào)或關(guān)閉了。
　　 本試驗結(jié)合消減雜交