大鼠硅肺纖維化組織cDNA消減文庫的構(gòu)建和差異表達(dá)基因的克隆.pdf

1、肺纖維化是一組由多種病因引起的肺破壞性疾病，肺纖維化過程包括肺組織的炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞以及隨后伴有的肺間質(zhì)細(xì)胞積聚的組織修復(fù)過程。在此過程中，肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等生物活性物質(zhì)，發(fā)揮直接或間接的作用，從而使這些參與肺纖維化的多種細(xì)胞共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，彼此間相互影響，共同促進(jìn)了病變發(fā)展。但目前對(duì)該疾病發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用的細(xì)胞分子機(jī)制尚不清楚，迄今為止仍未找到有效的防治

2、措施。目前肺纖維化的動(dòng)物研究模型大多數(shù)僅限于在病變?cè)缙?，尚未形成典型的肺纖維化病變，因此也不能分析肺纖維化病變與其他疾病的關(guān)系。目前認(rèn)為慢性阻塞性肺疾病、間質(zhì)性肺病(石棉肺、硅肺、特發(fā)性間質(zhì)性肺纖維化等)均為肺癌的危險(xiǎn)因素，間質(zhì)性肺纖維化引發(fā)肺癌的機(jī)制目前尚不清楚，大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，間質(zhì)性肺纖維化由于炎癥損傷和修復(fù)的相互作用可導(dǎo)致局部上皮反復(fù)的細(xì)胞及基因損傷，通過連續(xù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?nèi)缁?，異常增生，非典型增生而最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。故加深對(duì)

3、肺纖維化發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展新的治療策略已成為更加迫切的需要。 目的：本研究擬通過建立大鼠慢性硅肺纖維化動(dòng)物模型，利用SSH技術(shù)，篩選和鑒定硅肺纖維化大鼠與正常大鼠之間肺組織差異表達(dá)基因，旨在獲得與肺纖維化相關(guān)的特異表達(dá)基因，為肺纖維化發(fā)生機(jī)制及與其他疾病的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本研究以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用氣管插管灌注二氧化硅粉塵，經(jīng)過360天，建立硅肺肺纖維化動(dòng)物模型；應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)

4、，結(jié)合T/A克隆技術(shù)和藍(lán)白篩選構(gòu)建了硅肺肺纖維化正反向差異表達(dá)消減cDNA文庫(SNA，SNB)；經(jīng)過菌液PCR技術(shù)初步驗(yàn)證，插入片段大小，采用半定量RT-PCR技術(shù)證實(shí)部分基因確實(shí)存在差異表達(dá)，隨機(jī)挑取部分含有插入片段的克隆進(jìn)行測(cè)序分析及生物信息學(xué)分析。 結(jié)果： 1、360天，X線顯示大鼠肺紋理增粗，肺野有散在分布的高密度影出現(xiàn)。肉眼見肺組織表面及切面有散在分布的灰白色小結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)大小不等；顯微鏡下肺內(nèi)有典型的纖維性硅

5、結(jié)節(jié)形成，在部分硅結(jié)節(jié)周圍肺泡上皮細(xì)胞和管上皮明顯增生，部分細(xì)胞顯不同程度不典型增生，肺間質(zhì)纖維化明顯。 2、分別以肺纖維化肺組織cDNA為實(shí)驗(yàn)方(Tester)，以正常肺組織為對(duì)照方(Driver)，以正常肺組織cDNA為實(shí)驗(yàn)方(Tester)，以肺纖維化肺組織cDNA為對(duì)照方(Driver)構(gòu)建了反向差異表達(dá)消減cDNA文庫(SNB)。經(jīng)過菌液PCR技術(shù)初步驗(yàn)證，插入片段大小主要分布于200-600bp之間。隨機(jī)挑取正向和反

6、向消減文庫共52個(gè)含有插入片段的克隆進(jìn)行測(cè)序分析，共獲得47個(gè)有效差異表達(dá)cDNA片段。為證實(shí)這些基因確實(shí)存在差異表達(dá)，采用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)隨機(jī)挑選的硅肺纖維化肺組織消減文庫中的SNA-11、SNA-28、SNA-43、SNA-48，正常肺組織消減文庫中的SNB-13、SNB-30、SNB-42進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示它們?cè)诠璺卫w維化肺組織和正常肺組織中的表達(dá)存在差異，根據(jù)圖像掃描定量分析，在兩組肺組織中基因表達(dá)量相差在2

7、-5倍以上。 3、生物信息學(xué)分析表明雙向消減cDNA文庫測(cè)序得到的47個(gè)陽性克隆代表了35個(gè)基因，包含2個(gè)假想蛋白、4個(gè)推測(cè)的相似蛋白。其中大多數(shù)功能已知基因在細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)/運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞/機(jī)體防御、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯/表達(dá)調(diào)控、代謝等方面起重要作用。表明SSH技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因的有效方法，對(duì)這些基因功能的步研究，有利于從另外的角度了解肺纖維化的機(jī)制。 結(jié)論： 1成功建立了典型大鼠慢性硅肺纖維化動(dòng)物模型。