水稻條斑病菌激發(fā)植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)的基因發(fā)掘與利用研究.pdf

1、水稻條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc）是水稻黃單胞菌(X.oryzae)種下的兩個致病變種之一，引起水稻產(chǎn)生細(xì)菌性條斑病(簡稱條斑病)(BacterialLeaf Streak，BLS)，是水稻上的重要細(xì)菌病害。同其他革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌一樣，X.oryzae pv.oryzicola擁有保守的hrp基因簇，決定著病原菌在非寄主植物和抗病寄主上的過敏反應(yīng)(hypersensitive r

2、esponse，HR)和在感病寄主上致病性（pathogenicity）。hrp基因簇編碼形成Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TypeⅢ Secretion System，T3SS），在與植物互作時，X.oryzae pv.oryzicola將各種T3SS效應(yīng)蛋白注入植物細(xì)胞中從而導(dǎo)致非寄主產(chǎn)生HR和在寄主水稻上產(chǎn)生BLS癥狀。
　　 已有研究結(jié)果揭示，與同其它植物病原黃單胞菌一樣，X.oryzae pv.oryzicola中調(diào)控T3SS和T3S

3、S效應(yīng)蛋白的關(guān)鍵調(diào)控因子是HrpG和HrpX。為此，本實驗室前期研究中將X.oryzae pv.oryzicola野生型菌株RS105、hrpX基因突變體R△hrpX和hrpG基因突變體R△hrpG經(jīng)與水稻懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)后，通過基因芯片途徑獲得了一批可能受HrpG和HrpX調(diào)控的候選因子（資料未發(fā)表）。
　　 目前X.oryzae pv.oryzicola中唯一已知的harpin蛋白是由hrp基因簇中的hpa1基因編碼的。本文所在

4、實驗室的工作積累提示，X.oryzae pv.oryzicola中存在2個以上harpin類蛋白的編碼基因。為了發(fā)掘除hpa1以外新的harpin類蛋白編碼基因，本文基于harpin蛋白富含甘氨酸、不合半胱氨酸的特點以及受HrpG和HrpX調(diào)控的特征，從基因芯片數(shù)據(jù)中篩選出3個候選的harpin類蛋白編碼基因hlpA、hlpB和hlpC（harpin-like proten）。為了快速檢測3個候選基因是否能在非寄主煙草上激發(fā)HR，本研究

5、從RS105菌株中克隆了這3個基因并構(gòu)建至PVX病毒載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)在煙草上的瞬時表達(dá)，獲得了可激發(fā)煙草產(chǎn)生HR的能力的hlpB基因。
　　 為了了解HlpB蛋白的harpin蛋白特性，本研究通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對hlpB進(jìn)行了表達(dá)和純化。結(jié)果顯示，純化后的HlpB蛋白表現(xiàn)出了harpin蛋白的共同特征:熱穩(wěn)定，對蛋白酶K敏感，能激發(fā)煙草產(chǎn)生HR。梯度濃度實驗顯示，HlpB激發(fā)煙草產(chǎn)生HR的最小濃度為50μg/ml，高

6、于Hpa1的1μg/ml的濃度，并且在產(chǎn)生HR的煙草葉肉細(xì)胞發(fā)生明顯的基因組DNA片段化，表明HlpB和Hpa1蛋白一樣誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生的HR有著與細(xì)胞編程死亡(PCD)同樣的發(fā)生機制。
　　 HR一直被認(rèn)為是植物對病原物的一種抗性反應(yīng)。HlpB蛋白注射煙草8h后顯微鏡觀察結(jié)果顯示，HlpB能誘導(dǎo)煙草中活性氧迸發(fā)和胼胝質(zhì)的積累。進(jìn)一步的Northernblot顯示HlpB誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生HR時能激活HR標(biāo)志基因HIN1和HSR203J的

7、表達(dá)，同時也能激活病程相關(guān)蛋白PR1-a的表達(dá)，同時與非寄主抗性相關(guān)聯(lián)的BAK1、SGT1和MAP3K基因的表達(dá)也被顯著的激活。這說明，HlpB能激活植物的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)。這與已知的Hpa1相一致，所不同的是Hpa1能激活PR1-b的表達(dá)而HlpB則不能，暗示HlpB和Hpa1在激活植物防衛(wèi)反應(yīng)過程中所涉及的信號通路不完全相同。本研究的研究結(jié)果還顯示，HlpB注射NahG煙草時不能激發(fā)HR產(chǎn)生，表明HlpB激發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)依賴植物SA信

8、號積累和傳導(dǎo)。另外，HlpB的HR激發(fā)能力受真核生物代謝抑制劑（LaCl3，Actinomycin D和Cycloheximide）的抑制。以上結(jié)果表明，HlpB是X.oryzaepv.oryzicola中Hpa1之外的新harpin蛋白。
　　 為了研究hlpB基因在X.oryzae pv.oryzicola中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性，本研究將hlpB啟動子與報道基因gusA基因融合，導(dǎo)入野生型RS105在hrp誘導(dǎo)培養(yǎng)基XOM3和豐富

9、培養(yǎng)基NB中進(jìn)行GUS活性測定。結(jié)果顯示，hlpB啟動子可以驅(qū)動gusA基因在XOM3中表達(dá)，而不能在NB中有效表達(dá)，表明hlpB是受誘導(dǎo)表達(dá)的Real-time PCR檢測結(jié)果也說明了這一點。
　　 序列分析發(fā)現(xiàn)hlpB基因啟動子區(qū)域含有一個不完整的PIP-box(TTCGG-N19-TTCGT)，為了揭示HrpG和HrpX對hlpB基因的調(diào)控機制，本研究將hlpB啟動子中的PIP-box進(jìn)行點突變(AACGG-N19-TTC

10、GT)，與gusA基因融合后，分別導(dǎo)入野生型RS105、R△hrpG和R△hrpX中，進(jìn)行GUS活性測定。結(jié)果顯示，PIP-box突變后hlpB的表達(dá)不再依賴HrpG和HrpX調(diào)控，這說明hlpB基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受HrpG和HrpX的調(diào)控。
　　 為了明確HlpB蛋白在X.oryzae pv.oryzicola中是否依賴T3SS進(jìn)行分泌，本研究將純化的HlpB蛋白制備成多克隆抗體，在野生型RS105、T3SS突變體R△hrcC和R

11、△hrcV、 T3SS效應(yīng)蛋白出口控制突變體R△hpaB和R△hpaP中通過蛋白免疫雜交對其外泌蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)HlpB依賴完整的T3SS分泌到胞外，但不依賴HpaB和HpaP，這與已報道的Hpa1蛋白相一致。
　　 植物病原細(xì)菌中的harpin類都有促進(jìn)植物生長的功能。為了揭示HlpB對植物是否有促生作用，本研究通過HlpB純化蛋白處理煙草和擬南芥的種子，發(fā)現(xiàn)，在2周內(nèi)煙草和擬南芥的根系生長長度要明顯長于清水對照的處理，并且

12、平均每株幼苗鮮重是清水對照處理的2倍。這與之前在水稻條斑病菌中發(fā)現(xiàn)的Hpa1有著相同的促進(jìn)植物生長的能力。另外，HlpB誘導(dǎo)煙草還能產(chǎn)生SAR。經(jīng)HlpB處理的煙草與PBS蛋白溶液對照處理相比，煙草赤星病發(fā)病情況顯著下降，具體表現(xiàn)為病斑變小，幾乎不擴展。與Hpa1處理的煙草相比，赤星病發(fā)病情況無顯著差異。因此HlpB與其它harpin一樣，能激發(fā)植物SAR，顯著提高植物抗病性。
　　 為了明確hlpB是否參與了X.oryzae

13、pv.oryzicola在水稻上的毒性，本研究對已知harpin蛋白基因進(jìn)行了突變，獲得了hlpB基因的缺失突變體R△hlpB及hpa1和hlpB雙突變體R△hpa1△hlpB突變體。通過苗期水稻注射接種和成株期水稻針刺接種發(fā)現(xiàn)，hlpB的單突變體不影響X.oryzae pv.oryzicola在水稻上的致病性，但毒性較野生型有所下降。功能互補后突變體的毒性能恢復(fù)野生型水平。這表明，hlpB對X.oryzae pv.oryzicola的

14、全毒性有貢獻(xiàn)。有意思的是，R△hpa1△hlpB雙突變體仍能激發(fā)非寄主煙草產(chǎn)生HR，這提示X.oryzae pv.oryzicola中還存在其他HR激發(fā)因子。
　　 通過同源信息比對發(fā)現(xiàn)，hlpB廣泛存在于革蘭氏陰性病原細(xì)菌中，如E.coli、Pseudomonas、Xanthomonas、Ewinia、Ralstonia等，其中在植物病原Xanthomonas菌中高度保守（同源性達(dá)到90％以上）。為了明確這些同源蛋白是否也具有

15、HR激發(fā)活性，本研究將相應(yīng)的同源基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分別進(jìn)行表達(dá)和純化，然后注射煙草檢測HR產(chǎn)生能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有來自Xanthomonas屬中的HlpB蛋白能激發(fā)煙草產(chǎn)生HR，說明HlpB是Xanthomonas屬中保守的HR激發(fā)蛋白。同時為了說明植物病原黃單胞菌HlpB蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)特性，本研究利用Real-time PCR技術(shù)對hlpB同源基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，這些hlpB同源基因均是依賴誘導(dǎo)條件下進(jìn)行表達(dá)的。<

16、br>　　 鑒于X.oryzae pv.oryzicola的hpa1基因編碼產(chǎn)物具有在非寄主煙草上激發(fā)HR的能力，體外施用時能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種有益表型，如抗病、抗蟲及促生等，但Hpa1并沒有直接的殺菌活性。為了賦予Hpa1既具有HR誘導(dǎo)能力，又具有殺菌活性，本研究依據(jù)生物組合藥物學(xué)設(shè)計，通過基因工程途徑，獲得了具有上述功能的融合蛋白Hcm1。為此，本研究將(H)pa1和抗菌肽(C)ecropin A(CA)的活性α螺旋以及蜂毒素(M)

17、elittin(ME)的活性功能域巧妙的通過polylinker以及自由環(huán)進(jìn)行連接，融合構(gòu)建獲得具有上述雙重功能的融合基因hcm1。
　　 本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和膜蛋白提取途徑，獲得了純化的Hcm1蛋白。Hcm1保留了Hpa1在煙草上激發(fā)HR的能力，且能激活HR標(biāo)志基因HIN1和HSR203J基因以及防衛(wèi)反應(yīng)基因（PR1-a）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。抑菌活性能力測定發(fā)現(xiàn)，Hcm1有較好的廣譜抗菌性，對多數(shù)革蘭氏陰性病原細(xì)菌(E.col

18、i BL21(DE3)、R.solanacearumZJ3721、X.oryzae pv.oryzicola RS105和P.syringae pv.tomato DC3000）的生長有很強的抑制能力，對革蘭氏陽性細(xì)菌（B.subtilis B168）和病原真菌（A.alternate TBA28、T.cucumeris JS01、M.oryzae Guy11和F.graminearum ZF21）也有抑制生長作用。最小抑制濃度(MIC

19、)和致死中濃度(ED50)測定結(jié)果顯示，Hcm1蛋白對植物病原細(xì)菌R.solanacearum ZJ3721，X.oryzae pv.oryzicola RS105和P.syringae pv.tomatoDC3000的MIC和ED50分別是1.0-1.25μM和0.75μM、1.0-1.25μM和0.5-0.75μM、1.0μM和0.25-0.5μM，對病原真菌A.alternate TBA28、T.cucumeris JS01、M.

20、oryzaeGuy11和F.graminearum ZF21的MIC和ED50分別是6.0-7.5μM和4.0-5.0μM、3.5μM和2.0-2.5μM、2.5-3.0μM和1.25-1.5μM、3.5-4.0μM和2.5μM。Hcm1同Hpa1和cecropin A-melittin一樣對蛋白酶K敏感。
　　 為了說明Hcm1的防病作用，本研究選擇煙草TMV病毒病、稻瘟病和番茄細(xì)菌性枯萎病作為檢測對象。在煙草、水稻和番茄上間

21、隔3天施應(yīng)1.5μM濃度Hcm1兩次后，在接種TMV、稻瘟病菌和茄科青枯雷爾氏病菌后，發(fā)現(xiàn)，Hcm1防治TMV的效果為46.4％，而Hpa1的效果為35.7％; Hcm1防治稻瘟病的效果為47.3％，而Hpa1的效果僅為5.5％; Hcm1防治番茄青枯病的效果為38.9％，而Hpa1的效果僅為7.4％。這表明，Hcm1可以用于植物病害的防治而且效果好于harpin蛋白Hpa1，主要是cecropin A-melittin構(gòu)建于C-端Hp

22、a1的結(jié)果。在防治植物病害機理上，本文推測Hcm1保留了Hpa1通過SA途徑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生了SAR，而抗菌肽等可能因SA的積累而增強了活性。這種假說與BHT提高殺菌劑活性的模式較為吻合。但不管怎樣，利用HR激活因子Hpa1與抗菌肽進(jìn)行組合藥物學(xué)設(shè)計，還未見報道，并且這種雙重功能的融合基因為轉(zhuǎn)基因抗病植物品種的培育提供了基因資源。
　　 水稻黃單胞菌屬的hrp基因通過形成Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)將致病性的效應(yīng)蛋白注入植物細(xì)胞中從而決

23、定在非寄主植物上的過敏反應(yīng)和在寄主植物上的致病性。水稻白葉枯病菌X.oryzae pv.oryzae PXO99A的hpa2基因位于hrp基因簇最左端，啟動子區(qū)域存在imperfect PIP-box，其基因產(chǎn)物屬lytic transglycosylase家族，推測其可能溶解植物細(xì)胞壁從而使T3SS發(fā)揮作用。HrpF位于hrp基因簇的右端，在寄主細(xì)胞膜上形成轉(zhuǎn)位裝置將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運至寄主細(xì)胞中。
　　 盡管X.oryzae pv

24、.oryzae PXO99A中hpa2和hrpF已經(jīng)進(jìn)行單個基因的功能研究，但是Hpa2和HrpF是否存在互作關(guān)系，兩者是否影響T3S效應(yīng)蛋白的分泌或轉(zhuǎn)運尚不清楚。本研究顯示hpa2和hrpF基因分別突變后，降低了在水稻上的毒性，細(xì)菌生長能力減弱，但不影響在非寄主煙草上的HR，但是hpa2和hrpF同時突變后，X.oryzaepv.oryzae PXO99A在水稻上喪失了致病性，但在非寄主上仍有HR激發(fā)能力。
　　 本研究中通過