甜楊G6PDH抗凍機(jī)制及相關(guān)基因克隆.pdf

1、甜楊(P.suaveolens)是極其抗凍抗旱的高大喬木，其生存區(qū)的年平均氣溫為-3.8℃，極端最低氣溫為-46.9℃，冬季氣溫為-27.4℃～-40.5℃，年平均降雨量為493.4mm，無霜期僅為93天。因此，甜楊是一種研究木本植物抗凍機(jī)制及相關(guān)抗凍基因克隆的理想材料。G6PDH是PPP途徑的關(guān)鍵性調(diào)控酶，其主要功能是催化葡萄糖-6-磷酸氧化反應(yīng)，所產(chǎn)生的某些中間產(chǎn)物(RU5P和E4P等)以及產(chǎn)生NADPH可為蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、

2、固醇類等重要物質(zhì)的生物合成提供各種反應(yīng)底物和還原力，同時(shí)還涉及到多種環(huán)境脅迫而引起的植物應(yīng)答反應(yīng)。但至今未見有關(guān)木本植物G6PDH抗凍機(jī)制研究以及相關(guān)基因的克隆等方面的成功報(bào)道。 本研究以甜楊幼苗為試材，以G6PDH活性變化與抗凍性的關(guān)系為主線，以細(xì)胞抗凍性和膜穩(wěn)定性相關(guān)的各種生理生化指標(biāo)的測(cè)定為依據(jù)，研究了在-20℃低溫鍛煉過程中幼苗體內(nèi)的NADPH、NADH、H2O2和MDA含量以及半致死溫度LT50，抗氧化劑ASA、DHA

3、、GSH及GSSG含量，抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，磷酸戊糖途徑及糖酵解途徑的關(guān)鍵性調(diào)控酶(G6PDH和和PFK)活性，抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的關(guān)鍵性調(diào)控酶(APX、DHAR、MDAR和GR)活性以及抗氧化劑ASA、DHA、GSH及GSSG含量和蛋白質(zhì)含量的具體變化，從中探討G6PDH在低溫誘導(dǎo)甜楊幼苗抗凍性提高的可能作用，進(jìn)而闡明甜楊抗凍性的可能機(jī)制。另一方面，在G6PDH分離純化的前提下，研究了還原型二硫蘇糖醇(DTTred

4、)、pH值、代謝物及金屬離子對(duì)G6PDH活性的影響，并對(duì)該酶催化反應(yīng)特性進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)已有的擬南芥(Arabidopsisthaliana)和馬鈴薯(Solanumtuberosum)等植物的G6PDH基因的保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物，以甜楊的總RNA為模板，通過RT-PCR或RACE法釣取目的基因等克隆技術(shù)分離并確定與抗凍性相關(guān)的G6PDH基因，并對(duì)其核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。通過上述研究可得到以下主要結(jié)果：

5、 1.以甜楊G6PDH活性變化與抗凍性的關(guān)系為主線，以細(xì)胞抗凍性和膜穩(wěn)定性相關(guān)的各種生理生化指標(biāo)的測(cè)定為依據(jù)，對(duì)在-20℃低溫鍛煉及脫鍛煉過程中幼苗體內(nèi)的NADPH、NADH、H2O2和MDA含量，半致死溫度LT50，抗氧化劑ASA、DHA、GSH及GSSG含量，抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，磷酸戊糖途徑及糖酵解途徑的關(guān)鍵性調(diào)控酶(G6PDH和和PFK)活性，抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的關(guān)鍵性調(diào)控酶(APX、DHAR、MDAR

6、和GR)活性以及抗氧化劑ASA、DHA、GSH及GSSG含量和蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并對(duì)上述各理化指標(biāo)間的內(nèi)在聯(lián)系，以及它們與G6PDH活性變化及抗凍性的相關(guān)性進(jìn)行分析，這在國內(nèi)外上尚未報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低溫鍛煉所引起的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性、抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的關(guān)鍵性調(diào)控酶(APX、DHAR、MDAR和GR)活性、抗氧化劑ASA、DHA、GSH及GSSG含量以及蛋白質(zhì)含量的變化與G6PDH活性變化密

7、切相關(guān)，而且這些指標(biāo)的變化與幼苗MDA含量、H2O2含量以及半致死溫度LT50的降低密切相關(guān)。由此可認(rèn)為G6PDH可能參與了甜楊幼苗抗氧化酶活性及抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)能力的調(diào)節(jié)、抗氧化劑和膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān)物質(zhì)的合成以及抗凍性的低溫誘導(dǎo)，是甜楊抵御冰凍低溫的一種重要生理物質(zhì)。 2.為了探討低溫鍛煉對(duì)不同糖代謝途徑的影響效應(yīng)，對(duì)在低溫鍛煉和脫鍛煉中的G6PDH和PFK活性以及NADPH和NADH含量的變化進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

8、，在-20℃低溫鍛煉中，幼苗枝條內(nèi)的NADH含量的增加幅度以及PFK活性的提高程度分別不如NADPH含量和G6PDH活性明顯，但脫鍛煉所引起的下降程度卻分別比NADPH含量和G6PDH活性顯著。這說明低溫鍛煉對(duì)酵解途徑的影響效應(yīng)相對(duì)較小，反映出不同糖代謝途徑對(duì)低溫脅迫應(yīng)答具有一定的差異。據(jù)此可認(rèn)為，低溫鍛煉可能引起了體內(nèi)糖代謝途徑的改變與能量的適應(yīng)性變化，而甜楊幼苗在低溫下可能主要是通過PPP途徑來產(chǎn)生高水平的NADPH，才能滿足與抗凍

9、性發(fā)育有關(guān)的RNA、蛋白質(zhì)等生物合成的需要。 3.細(xì)胞抗氧化能力與抗凍性關(guān)系的研究結(jié)果表明，低溫鍛煉所引起的SOD、POD和CAT活性提高的幅度均小于APX、DHAR、MDAR和GR、而且也小于抗氧化劑ASA、DHA、GSH和GSSG含量的增加幅度；另外，脫鍛煉2d后，經(jīng)低溫鍛煉的幼苗其體內(nèi)APX、DHAR、MDAR、GR、ASA、DHA、GSH和GSSG下降幅度均小于SOD、POD和CAT，而且APX、DHAR、MDAR和GR

10、活性以及ASA、DHA、GSH和GSSG含量仍高于未鍛煉幼苗水平。由此可見，不同抗氧化酶在細(xì)胞內(nèi)清除H2O2的過程中所起的作用存在著一定的差異，在低溫脅迫下甜楊幼苗內(nèi)H2O2的清除主要是通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)來實(shí)現(xiàn)的。這也在一定程度上反映出低溫鍛煉的幼苗在脫鍛煉后還能保持較高的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)能力和清除H2O2能力，可能與維持脫鍛煉后幼苗恢復(fù)正常生長的需要有關(guān)。 4.首次以從-20℃低溫鍛煉的甜楊幼苗中分離純化的G6P

11、DH為研究對(duì)象，研究了還原型二硫蘇糖醇(DTTred)、pH值、代謝物及金屬離子對(duì)G6PDH活性的影響，并對(duì)該酶催化反應(yīng)特性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分離純化的G6PDH定位于細(xì)胞質(zhì)、其最適反應(yīng)pH值為8.2，而且NADPH、NADH、GTP、UTP、ATP、AMP、ADP、CoA、AcetylCoA、F6P、E4P、R5P和3-PG處理對(duì)該酶活性均有不同程度抑制，其中NADPH抑制作用較強(qiáng)；Mg2+、Ca2+和K+對(duì)該酶活性沒有影響，而C

12、d2+對(duì)該酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。另外，該酶的最大反應(yīng)速度為68U/mgprotein，底物G6P和NADP的米氏常數(shù)(Km)分別為360μmol/L和16μmol/L，表明甜楊細(xì)胞質(zhì)的G6PDH活性高于已報(bào)道的其他植物材料的G6PDH活性。 5.根據(jù)已有的擬南芥、煙草和馬鈴薯的G6PDH基因的保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)成功地從甜楊總RNA中擴(kuò)增出長度為1200bp的G6PDH基因，可編碼367個(gè)氨基酸，這是國內(nèi)

13、外首次獲得木本植物G6PDH基因。該基因片段命名為PsG6PDH，現(xiàn)己在Genbank上登記(Y445917)。同源性分析發(fā)現(xiàn)，甜楊PsG6PDH基因序列與馬鈴薯、煙草和紫色苜蓿的細(xì)胞質(zhì)的G6PDH基因序列具有較高同源性，但與馬鈴薯質(zhì)體的G6PDH基因序列的同源性較低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所編碼的氨基酸序列與小麥、馬鈴薯、煙草、水稻和擬南芥的細(xì)胞質(zhì)的G6PDH基因編碼氨基酸序列的一致率也相對(duì)較低，而且基因長度及其編碼的氨基酸數(shù)目均明顯短于水

14、稻、小麥、馬鈴薯、煙草和擬南芥等植物，但具有與水稻、小麥、馬鈴薯、煙草和擬南芥等植物完全一致的NADP結(jié)合位置NEFVIRLQP結(jié)構(gòu)以及底物G6P結(jié)合位置的IDHYLG序列。據(jù)此可認(rèn)為，本實(shí)驗(yàn)所克隆的甜楊PsG6PDH編碼的G6PDH可能為細(xì)胞質(zhì)的G6PDH，而且其編碼的氨基酸與小麥、煙草、馬鈴薯、水稻和擬南芥等在生理功能上存在一定差異。同時(shí)，也在一定程度上暗示了高大喬木甜楊的G6PDH基因可能有別于其它草本植物的G6PDH基因。