前列腺素和槲皮素對(duì)雞等級(jí)前卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)作用及機(jī)理的研究.pdf

1、禽蛋生產(chǎn)是當(dāng)今畜牧業(yè)中的高效產(chǎn)業(yè)之一，而禽類的產(chǎn)蛋性能主要取決于卵巢中卵泡的生長發(fā)育水平，并受品種、環(huán)境和飼養(yǎng)管理等因素的影響。禽類的大量卵泡僅少數(shù)能發(fā)育成熟，大約僅5％能發(fā)育到小黃卵泡。卵泡經(jīng)過發(fā)育、選擇和閉鎖等機(jī)制建立起嚴(yán)格的等級(jí)體系，卵泡經(jīng)等級(jí)前發(fā)育進(jìn)入小黃卵泡庫，被選擇進(jìn)入等級(jí)發(fā)育的優(yōu)勢(shì)卵泡按順序發(fā)育，直至排卵。禽類的卵泡發(fā)育與哺乳類不同之處在于其卵泡較大而易辨認(rèn)其發(fā)育階段，而且在產(chǎn)蛋周期內(nèi)同時(shí)存在不同發(fā)育階段的卵泡，因而可作為

2、研究卵泡發(fā)育和閉鎖的極佳模型。因此，禽類卵泡發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)于提高禽類的產(chǎn)蛋性能、改良禽蛋品質(zhì)等具有重要的指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)以振寧土雞為材料，通過分離產(chǎn)蛋雞等級(jí)前小黃卵泡外膜層細(xì)胞(theca externacell，TEC)和顆粒細(xì)胞(granulosa cell，GC)，研究前列腺素(prostaglandin)、胰島素樣生長因子-I(insulin-like growth factor I，IGF-I)和花生四烯酸(arachi

3、donic acid，AA)對(duì)TEC生長發(fā)育和功能的影響及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制；同時(shí)還研究了槲皮素(quercetin，Que)對(duì)環(huán)境重金屬鎘(cadmium，Cd)引起的雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞毒性的修復(fù)作用，這些結(jié)果將為家禽優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇及繁殖生產(chǎn)性能的提高提供有價(jià)值的理論依據(jù)。
　　 1.等級(jí)前小黃卵泡外膜層細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立和應(yīng)用
　　 采用機(jī)械法和膠原酶法消化分散成年產(chǎn)蛋雞等級(jí)前小黃卵泡外膜層組織，用0.5％去類

4、固醇胎牛血清和M199培養(yǎng)液建立TEC體外培養(yǎng)模型，12 h后TEC貼壁呈梭狀生長，用3β-HSD染色鑒定TEC，BrdU摻入法檢測(cè)黃體生成素(LH)對(duì)TEC增殖活性的影響。結(jié)果表明，利用去類固醇胎牛血清體外培養(yǎng)TEC，細(xì)胞生長良好而且避免了血清中類固醇激素對(duì)藥物的可能影響，是一種評(píng)價(jià)外源性激素離體生物效應(yīng)的簡(jiǎn)易、快速和準(zhǔn)確并且易于觀察的良好模型，可用于TEC增殖活性調(diào)控及相關(guān)功能的研究。
　　 2.前列腺素對(duì)外膜層細(xì)胞的促增殖

5、作用及其機(jī)理研究
　　 本實(shí)驗(yàn)研究了前列腺素(PGE1)對(duì)等級(jí)前小黃卵泡TEC增殖的作用及其作用機(jī)理。單層培養(yǎng)的TEC用0.5％去類同醇胎牛血清預(yù)培養(yǎng)12 h后換培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)單獨(dú)添加前列腺素PGE1(0.1～100 ng/ml)或LH(0.1～100 IU/ml)處理24 h。當(dāng)PGE1濃度在0.1～10ng/ml范圍時(shí)，TEC的增殖作用呈上升趨勢(shì)，當(dāng)濃度達(dá)到100 ng/ml時(shí)，其作用呈下降趨勢(shì)，其中10 ng/m

6、l的PGE1促增殖作用最顯著；LH的作用效果與PGE1類似，以10 IU/ml濃度的促增殖作用最為明顯。PGE1作用機(jī)理的研究結(jié)果表明，應(yīng)用前列腺素受體EP2阻斷荊SC19220(10-7～10-5mol/L)分別與LH或PGE1聯(lián)合處理后，LH和PGE1的促增殖作用均被顯著抑制，且呈劑量效應(yīng)；前列腺素合成酶抑制劑消炎痛(10-7～10-5mol/L，)與LH聯(lián)合后，LH對(duì)TEC的促增殖作用也呈劑量效應(yīng)被抑制。同時(shí)PGE1對(duì)小黃卵泡TE

7、C促增殖作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究表明：通過添加PKA、PKC信號(hào)途徑激活劑及其相應(yīng)的抑制劑(H89和H7)，發(fā)現(xiàn)PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在PGE1的促小黃卵泡TEC增殖過程中起主導(dǎo)作用；BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定結(jié)果與上述結(jié)果呈相同趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄因子CREB1免疫細(xì)胞組化結(jié)果表明，PGE1可促進(jìn)細(xì)胞核因子CREB1核轉(zhuǎn)位；半定量RT-PCR結(jié)果也表明PGE1顯著上調(diào)了細(xì)胞周期蛋白(CCND1和CCNE1)和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK6和CD

8、K2)及轉(zhuǎn)錄因子CREB1mRNA的表達(dá)，這種上調(diào)作用可被H89、SC19220或消炎痛顯著抑制。同時(shí)，卵泡體外培養(yǎng)的結(jié)果表明：PGE1(10 ng/ml)顯著增加了外膜層的厚度和細(xì)胞密度。上述結(jié)果表明PGE1可通過LH介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CREB1，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白(CCND1和CCNE1)和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK6和CDK2)基因的表達(dá)，促進(jìn)小黃卵泡TEC的增殖，進(jìn)而調(diào)節(jié)雞等級(jí)前卵泡的發(fā)育。

9、r>　　 3.前列腺素和胰島素樣生長因子的互作對(duì)外膜層細(xì)胞增殖作用影響
　　 本實(shí)驗(yàn)研究前列腺素(PGE2)和IGF-I間的相互作用對(duì)雞等級(jí)前小黃卵泡TEC增殖影響。結(jié)果表明：當(dāng)IGF-I濃度在1～100 ng/ml范圍時(shí)，TEC的增殖作用呈上升趨勢(shì)，當(dāng)濃度達(dá)到1000 ng/ml時(shí)，其作用呈下降趨勢(shì)，其中100 ng/ml的IGF-I促增殖作用最明顯；PGE2增殖作用趨勢(shì)同IGF-I類似，在10 ng/ml的促增殖作用最顯著

10、。IGF-I作用機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)：IGF-I受體(IGF-IR)抑制劑AG1024(10-6～10-8 mol/L)、蛋白激酶B(PKB&AKT)抑制劑KP372-1(10-6～10-8 mol/L)、環(huán)氧和酶-2(COX-2)抑制劑NS398(10-6～10-8mol/L)與IGF-I聯(lián)合處理后，IGF-I的促增殖作用被顯著抑制，且呈劑量效應(yīng)；Real-time PCR和ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-I顯著提高了外膜層細(xì)胞COX-2 mRNA

11、的表達(dá)和PGE2的分泌，與AG1024、KP372-1、NS398聯(lián)合處理后COX-2的表達(dá)水平和PGE2分泌量均被顯著降低；同時(shí)IGF-I與NS398聯(lián)合后再添加PGE2的補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PGE2對(duì)NS398抑制的IGF-I誘導(dǎo)的TEC的增殖有明顯補(bǔ)救作用，這表明COX-2在介導(dǎo)IGF-I促增殖作用中發(fā)揮重要作用。此外KP372-1顯著抑制PGE2促增殖作用，而SC19220抑增殖作用不明顯；Real-time PCR結(jié)果表明PGE2顯

12、著上調(diào)了COX-2mRNA的表達(dá)，這種上調(diào)作用受到KP372-1和NS398明顯抑制，同時(shí)PGE2和IGF-1皆顯著提高了IGF-IR的表達(dá)，AG1024降低了二者誘導(dǎo)的IGF-IR表達(dá)。卵泡體外培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-I(100 ng/ml)、PGE2(10 ng/ml)及IGF-I+PGE2處理組可顯著增加小黃卵泡中外膜層的厚度和細(xì)胞密度，其中以IGF-I+PGE2聯(lián)合處理組效果最明顯。上述結(jié)果表明IGF-I與其受體結(jié)合后通過PKB信號(hào)

13、通路，激活了COX-2表達(dá)，促進(jìn)了內(nèi)源性PGE2的合成分泌，而PGE2與其細(xì)胞膜上特異性的受體結(jié)合后一方面上調(diào)IGF-IR的表達(dá)，通過PKB信號(hào)通路，正反饋激活COX-2表達(dá)，協(xié)同IGF-I刺激生成內(nèi)源性PGE2，另一方面通過PKB介導(dǎo)，激活下游相關(guān)因子，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖。這表明IGF-I和PGE2形成了一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的正反饋循環(huán)通路，通過不同信號(hào)間的交互作用，加速了小黃卵泡外膜層細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)了雞等級(jí)前卵泡的發(fā)育。
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14、.花生四烯酸對(duì)外膜層細(xì)胞增殖、活性及功能的影響
　　 AA是一類順式多不飽和脂肪酸，是動(dòng)物細(xì)胞膜磷脂的重要組成部分，作為前列腺素合成的前體物在調(diào)節(jié)動(dòng)物生殖過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究了花生四烯酸對(duì)TEC增殖、活性及功能的影響。結(jié)果表明AA(10-4～10-7mol/L)對(duì)TEC沒有明顯的促增殖作用，但是可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞活性，10-6mol/L時(shí)細(xì)胞活性最強(qiáng)，同時(shí)PKC抑制劑H7(10-8～10-6 mol/L)與AA聯(lián)合后，A

15、A對(duì)細(xì)胞活性的增強(qiáng)作用呈劑量效應(yīng)被抑制。AA對(duì)細(xì)胞的功能研究發(fā)現(xiàn)：AA(10-6mol/L)激活了PKC，促進(jìn)其從胞質(zhì)到膜的轉(zhuǎn)位；上調(diào)了鈣粘連蛋白(E-cadherin)、β-連鎖蛋白(β-catenin)和縫隙連接蛋白-43(Connexin-43)的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)Ⅳ型膠原粘附性；此外流式細(xì)胞結(jié)果也表明AA對(duì)細(xì)胞的凋亡有抑制作用。當(dāng)添加H7(10-7mol/L)與AA(10-6mol/L)聯(lián)合處理后，AA(10-6mol/L)

16、對(duì)鈣粘連蛋白、β-連鎖蛋白和縫隙連接蛋白-43的表達(dá)上調(diào)作用被顯著抑制，同時(shí)細(xì)胞對(duì)Ⅳ型膠原黏附性也顯著下降。上述結(jié)果表明AA可能通過PKC介導(dǎo)，上調(diào)鈣粘連蛋白、β-連鎖蛋白和縫隙連接蛋白-43的表達(dá)及細(xì)胞對(duì)Ⅳ型膠原黏附性，增強(qiáng)了細(xì)胞間信息交流，提高了細(xì)胞活性，抑制了細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其調(diào)控細(xì)胞功能的作用，進(jìn)而促進(jìn)雞等級(jí)前卵泡的發(fā)育。
　　 5.槲皮素對(duì)鎘引起的雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞毒性的緩解作用
　　 槲皮素是屬于黃酮類化合

17、物的一種，在蔬菜和水果等植物中含量豐富，具有抗癌，抗炎，抗氧化和抗凋亡等重要的生物學(xué)功能。鎘是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，可以引起自由基的產(chǎn)生和氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致生殖系統(tǒng)的損傷。為此，本研究利用產(chǎn)蛋雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)模型研究了槲皮素對(duì)鎘誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞損傷的緩解作用及其機(jī)理。結(jié)果表明氯化鎘(5μM)處理24 h后顯著降低了顆粒細(xì)胞的數(shù)目和細(xì)胞活性，誘導(dǎo)了脂質(zhì)過氧化作用引起丙二醛(MDA)含量增加，GSH-Px和SOD活性降低，激活了Ca

18、spase-3，促進(jìn)其從胞質(zhì)到核的轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體的收縮和DNA片段化。Western-blot和半定量RT-PCR結(jié)果表明氯化鎘誘導(dǎo)了促凋亡蛋白BAX的表達(dá)，抑制了抑凋亡蛋白BCL2和XIAP的表達(dá)；同時(shí)顆粒細(xì)胞通過Annexin V/PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞儀分析和Tunel免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定也表明鎘主要通過誘導(dǎo)了顆粒細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。添加槲皮素(1μg/m1)可顯著降低MDA生成量，恢復(fù)GSH-Px和SOD活性；同時(shí)刺激BC

19、L2和XIAP的表達(dá)，抑制BAX的表達(dá)和Caspase-3激活，從而降低了細(xì)胞凋亡的比率。上述結(jié)果表明槲皮素可以通過氧化損傷的修復(fù)和調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)及抑制Caspase-3的活性來緩解鎘對(duì)顆粒細(xì)胞造成的毒性作用，這也表明槲皮素對(duì)重金屬鎘引起的細(xì)胞毒性具有潛在的保護(hù)作用。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用0.5％去類固醇胎牛血清和M199培養(yǎng)液建立外膜層細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，能夠用于研究外膜層細(xì)胞的分化、增殖、形態(tài)變化以及這種專一性細(xì)

20、胞的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在此模型上發(fā)現(xiàn)PGE1通過LH介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CREB1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)小黃卵泡TEC的增殖；IGF-I則通過PKB信號(hào)通路上調(diào)COX-2的表達(dá)進(jìn)而增加了PGE2的合成，而后形成了一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的正反饋循環(huán)通路，并通過不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交聯(lián)，加速了小黃卵泡外膜層細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)了等級(jí)前卵泡的發(fā)育。而AA通過PKC介導(dǎo)，增強(qiáng)外膜層細(xì)胞粘附和信息交流，提高了細(xì)胞活性，抑制了細(xì)