水稻油菜素內(nèi)酯合成途徑中的關(guān)鍵基因CYP90D2-D2的圖位克隆及功能分析.pdf

1、水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的糧食作物之一。隨著耕地面積的縮小和世界人口的迅速增長(zhǎng)，提高水稻的產(chǎn)量對(duì)解決未來(lái)全球的糧食安全問(wèn)題具有十分重要的戰(zhàn)略意義。株高是是影響水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。上世紀(jì)六七十年代，半矮化水稻新品種在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用極大地提高了水稻的產(chǎn)量，這被譽(yù)為水稻上的“綠色革命”。矮化突變體是研究水稻矮化機(jī)制的理想材料。迄今為止，雖然在水稻中報(bào)道了不少矮化突變體，但大多數(shù)是半矮化突變體，對(duì)極端矮化突變體遺傳

2、及分子機(jī)理的研究還比較少。本研究利用一個(gè)組織培養(yǎng)得來(lái)的極端矮化突變體chromosomesegmentdeleteddwarf1(csdd1)，通過(guò)基因的圖位克隆和功能分析，揭示了引起csdd1突變體極端矮化表型的遺傳和分子機(jī)理，并且從細(xì)胞形態(tài)及生理等方面對(duì)csdd1突變體進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究。這加深了對(duì)水稻矮化機(jī)制的研究，并且為水稻矮化突變體在育種及生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　csdd1是從日本特早熟粳稻

3、品種Kitaake的組培后代中發(fā)現(xiàn)的極端矮化突變體。該突變體表現(xiàn)為所有節(jié)間都不伸長(zhǎng)，莖桿變粗，葉傾角變小，葉片扭曲、深綠，不育。節(jié)間細(xì)胞形態(tài)觀察表明，csdd1的節(jié)間細(xì)胞未伸長(zhǎng)，這是其節(jié)間不伸長(zhǎng)的主要原因。csdd1的莖桿被所有的葉鞘包裹，并且節(jié)間橫切面的細(xì)胞層數(shù)顯著增加，這是csdd1莖桿變粗的兩個(gè)主要原因。葉片橫切面的細(xì)胞形態(tài)觀察表明，csdd1中脈的結(jié)構(gòu)存在缺陷，這種結(jié)構(gòu)缺陷不利于葉片的伸展。觀察還發(fā)現(xiàn)csdd1葉片上表皮的泡狀細(xì)

4、胞數(shù)目減少，細(xì)胞皺縮、體積變小，這不利于泡狀細(xì)胞吸水膨脹，從而影響葉片的伸展。這兩方面因素可能引起了csdd1葉片扭曲的表型。葉片色素含量測(cè)定及電鏡觀察結(jié)果表明，csdd1葉片深綠的表型是由色素含量增加及葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化引起的。
　　遺傳分析結(jié)果表明csdd1突變體的表型由隱性單基因控制。以csdd1/+雜合植株與9311配置的BC2F2精細(xì)定位群體，采用隱性極端個(gè)體定位法，使用2332個(gè)隱性極端個(gè)體將csdd1定位于第一染色體

5、短臂的約220kb的區(qū)間內(nèi)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)csdd1在定位區(qū)間內(nèi)發(fā)生了約168kb的染色體片段缺失。利用基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)csdd1缺失片段進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)缺失片段上共包含23個(gè)基因。對(duì)這23個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)其中的15個(gè)基因在野生型中是表達(dá)的。因此csdd1的候選基因很可能在這15個(gè)基因之中。
　　根據(jù)水稻基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這15個(gè)基因功能的分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中的CYP90D2/D2基因編碼油菜素內(nèi)酯(Bras

6、sinosteroid，BR)合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵合成酶。BR是一種具有促進(jìn)細(xì)胞分裂及伸長(zhǎng)，調(diào)控植物株高等功能的甾醇類植物激素，因此D2很可能是csdd1的候選基因。我們?cè)谒綯-DNA插入突變體庫(kù)中篩選到了兩份D2基因的T-DNA突變體，它們具有與csdd1突變體十分相似的極端矮化表型。在黑暗條件下生長(zhǎng)時(shí)，csdd1及T-DNA突變體表現(xiàn)出BR突變體所特有的“去黃化”特征，說(shuō)明它們是BR相關(guān)突變體。外源BR激素處理csdd1能使突變體

7、的株高得到恢復(fù)，說(shuō)明csdd1是BR合成缺陷突變體。T-DNA標(biāo)簽和表型的共分離驗(yàn)證表明這兩份T-DNA突變體的表型是由T-DNA插入D2基因引起的?；虮磉_(dá)分析表明D2基因在csdd1及T-DNA突變體中都不表達(dá)，這說(shuō)明它們是D2基因的完全缺失功能突變體。因此，我們把D2基因定為csdd1的候選基因。
　　將野生型D2基因轉(zhuǎn)入csdd1中互補(bǔ)了突變體的表型。在csdd1中過(guò)表達(dá)D2基因也使突變體的表型得到了恢復(fù)。而在csdd1中

8、互補(bǔ)或過(guò)表達(dá)缺失片段上的其它6個(gè)候選基因卻不能使突變體的表型得到恢復(fù)。用RNA干擾技術(shù)抑制野生型中D2基因的表達(dá)，T0轉(zhuǎn)基因后代中出現(xiàn)了極端矮化表型的干擾植株?；虮磉_(dá)分析表明D2基因在這些干擾植株中不表達(dá)。這些結(jié)果證明csdd1突變體的表型是由D2基因缺失引起的。
　　氨基酸序列同源性和進(jìn)化樹(shù)分析表明D2基因?yàn)榧?xì)胞色素P450中的CYP90基因亞家族的成員?；虻慕M織特異性表達(dá)分析表明，D2基因在細(xì)胞快速分裂和伸長(zhǎng)的組織中表達(dá)較

9、強(qiáng)，這和BR調(diào)控細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)的功能是一致的。黑暗條件促進(jìn)D2基因的表達(dá)，而光照及外源BR處理抑制D2基因的表達(dá)，這說(shuō)明D2基因的表達(dá)受光及BR負(fù)反饋機(jī)制的調(diào)控。BR相關(guān)基因表達(dá)分析表明，在csdd1及D2基因的T-DNA突變體中，BR信號(hào)及響應(yīng)基因的表達(dá)量都有不同程度的下調(diào)。這可能反映了這些突變體中的BR含量降低，BR信號(hào)及響應(yīng)基因?qū)R的應(yīng)答減弱。
　　d2-1及d2-2是D2基因的單堿基輕微矮化突變體，d2-1的第二節(jié)間不伸

10、長(zhǎng)，d2-2的第二節(jié)間縮短。csdd1、d2-3及d2-4T-DNA突變體中的D2基因都完全缺失功能;它們?cè)诓煌z傳背景下都表現(xiàn)出極端矮化表型;并且csdd1在T65及9311遺傳背景中也表現(xiàn)為極端矮化表型。這些結(jié)果說(shuō)明csdd1、d2-3及d2-4這類極端矮化突變體與d2-1及d2-2輕微矮化突變體的表型差異不是由于遺傳背景差異引起的，而是由于D2基因突變的嚴(yán)重程度不同引起的。csdd1與d2-1突變體的等位性測(cè)驗(yàn)表明，d2-1相對(duì)c