兩種抗病毒策略介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因研究和煙草脈帶花葉病毒蛋白的表達.pdf

1、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)是煙草上的三大主要病毒病。病毒間的復(fù)合侵染非常普遍，往往給煙草生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。本研究利用適體和小干擾。RNA2種不同的策略獲得了同時抗2種或3種病毒的轉(zhuǎn)基因煙草。煙草脈帶花葉病毒(Tobacco veinbanding mosaic virus，TVBMV)屬于馬

2、鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)病毒，近幾年在我國煙草上的發(fā)生有上升和蔓延的趨勢。本研究獲得了TVBMV YND分離物的全基因組序列，利用原核表達方法成功表達了TNBMV10個蛋白中除了P3蛋白之外的9個，并利用鎳柱對部分蛋白進行了純化，同時制備了TVBMV CP的抗血清。主要結(jié)果如下： 將編碼一個九肽(與CMV CP互作)和PVYHC-Pro N端83個氨基酸(與HC-Pro蛋白自身互作)的基因片段(C-P)與GFP基因(G

3、FP)同時連接到pMD18-T載體，通過定點突變獲得了3個突變體。將C-P-GFP及其3個突變體分別連接到植物表達載體pROK Ⅱ上，農(nóng)桿菌共浸潤后接種實驗篩選到最有效的抗性誘導(dǎo)載體。將此載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化煙草K326，分子檢測獲得了15棵轉(zhuǎn)基因煙草?？共⌒詫嶒灡砻鳙@得抗PVY的轉(zhuǎn)基因煙草1棵，抗CMV的植株3棵，同時抗PVY和CMV的植株1棵。首次利用適體策略獲得了同時抗PVY和CMV的轉(zhuǎn)基因煙草。 利用軟件篩選到能

4、夠有效切割PVX和CMV CP基因的siRNA以及PVY HC-Pro基因中能夠有效形成siRNA的區(qū)域，將篩選片段連接構(gòu)建反向重復(fù)的植物表達載體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草K326，分子檢測證明成功獲得了22棵轉(zhuǎn)基因煙草?？共⌒苑治霰砻鳙@得了2棵抗PVY、8棵抗CMV和6棵抗PVX的轉(zhuǎn)基因煙草，同時抗3種病毒的轉(zhuǎn)基因煙草1棵。ELISA和實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果表明抗病的轉(zhuǎn)基因植株中病毒含量均明顯低于感病對照，說明篩選的siRNA能夠特

5、異性地降解病毒的mRNA，有效抑制病毒的復(fù)制。 利用針對馬鈴薯Y病毒屬病毒的簡并或特異引物，通過RT-PCR方法擴增得到TVBMV云南分離物YND的全基因組序列。除了3'-端poly(A)外，YND基因組全序列包括9570個核苷酸，含有一個大的開放閱讀框，編碼一個由3079個氨基酸組成的多聚蛋白，分子量約為348.6 kDa。該分離物的NIb/CP切割位點為Q/N，這在馬鈴薯Y病毒屬病毒中非常少見。另外，HC-Pro中含有比較罕

6、見的參與蚜傳的RITC基序。 將TVBMV CP基因克隆到表達載體pET-22b(+)上，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達出分子量為35.0 kDa的融合蛋白。利用該融合蛋白制備了YVBMV的多克隆抗體，ELISA測定抗血清效價為1/4096。Western blotting和DIBA分析結(jié)果表明，獲得的抗血清和原核表達的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特異性反應(yīng)，可用于TVBMV的快速檢測。同時在大腸桿菌中成功表達了TV