禽源NDV Hbnu株分離培養(yǎng)鑒定、F基因測序分析.pdf

1、目的：新城疫病毒(Neweastle disease virus， NDV)屬副粘病毒科Avulavirus屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒，由Doyle于1927年首次分離并命名。NDV能夠在禽類中引起一種致死率極高的急性接觸性傳染病----新城疫，雞、火雞及野雞等都有易感性。NDV在極少數(shù)情況下可以感染人類，表現(xiàn)為輕微的結(jié)膜炎或溫和的呼吸道癥狀，目前沒有發(fā)現(xiàn)人到人的水平感染，但近些年來新城疫病毒更多的是以其抗腫瘤作用強(qiáng)、對(duì)人安全性高等特點(diǎn)吸

2、引著越來越多的關(guān)注。NDV能感染多種人類腫瘤細(xì)胞且不依賴于腫瘤細(xì)胞增殖而獨(dú)立復(fù)制繁殖，腫瘤細(xì)胞不能發(fā)揮有效的抗病毒作用是因?yàn)楦蓴_素信號(hào)轉(zhuǎn)換途徑的損傷，從而使NDV在細(xì)胞中生長復(fù)制，進(jìn)一步殺傷腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為未知序列的新城疫病毒HBnu株，目的在于通過分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)及信息技術(shù)方面的方法對(duì)其F基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，也出于對(duì)實(shí)驗(yàn)室安全的考慮，分析F基因112～117位點(diǎn)，可以確定其型別及致病性、抗腫瘤細(xì)胞選擇性等。
　　

3、 方法：選取本校分離自圈養(yǎng)禽類的HBnu株（2008年分離），接種雞胚以擴(kuò)增病毒，48h后收取雞胚尿囊液，測定血凝效價(jià)≥1:1280后，其血凝性均可被NDV的陽性血清所抑制而不被禽流感(H9和H5)單因子陽性血清及EDS-76陽性血清抑制。采用紅細(xì)胞吸附釋放法純化病毒，使其血凝效價(jià)≥1:1280，常規(guī)復(fù)蘇人傳代食道癌細(xì)胞ECA109細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，復(fù)蘇后選擇生長狀態(tài)良好，密度較大的進(jìn)行NDV HBnu株感染試驗(yàn)，觀察其抗腫瘤效果，

4、選擇最好溶瘤效果的病毒液進(jìn)行分子生物學(xué)研究，用RNA試劑盒提取病毒RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank上所公布的新城疫病毒的全基因組序列和相關(guān)參考文獻(xiàn)，采用Primer5.0系統(tǒng)設(shè)計(jì)3對(duì)引物，引物設(shè)計(jì)采取使擴(kuò)增片段之間部分相互重疊的原則，使片段連接起來可以覆蓋整個(gè)病毒基因組，特異性片段的PCR產(chǎn)物純化并測序，從而獲得F基因組序列，并通過生物信息學(xué)軟件對(duì)其與其他NDV國際毒株進(jìn)行了比較分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定NDV HB

5、nu株的分子生物學(xué)特征及進(jìn)化關(guān)系，其關(guān)鍵序列為：112G-K-Q-G-R-L117，符合國際標(biāo)準(zhǔn)弱毒株規(guī)律，判定NDV HBnu株為弱毒株。
　　 結(jié)果：NDV HBnu株第一次經(jīng)過SPF雞胚擴(kuò)增后測定的血凝效價(jià)，第二次經(jīng)過紅細(xì)胞吸附釋放法后測定的血凝效價(jià)后測定的血凝效價(jià)均≥1:1280，得出NDV HBnu株的HA蛋白功能完整，具有凝血活力，初步驗(yàn)證該病毒株具有正常的病毒毒力。
　　 通過對(duì)ECA109細(xì)胞感染后的凋亡

6、實(shí)驗(yàn)，再次證明NDV HBnu株具有細(xì)胞殺傷作用，而且病毒毒力正常。
　　 NDV HBnu株F基因序列均由1707個(gè)堿基組成，屬于基因Ⅱ型，與GenBank公布的clone30株和LaSota弱毒株的F基因序列長度相近，通過序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)clone30株和LaSota弱毒株的同源性較高，屬于進(jìn)化樹同一分支。NDV HBnu株的F基因關(guān)鍵位點(diǎn)112～117為GlyLys-Gln-Gly- Arg-Leu符合國際標(biāo)準(zhǔn)弱毒株規(guī)

7、律，判定NDV HBnu株為弱毒株。
　　 結(jié)論：
　　 1.NDV HBnu株是一株具有殺傷腫瘤細(xì)胞且具有正常病毒毒力的毒株，抗腫瘤細(xì)胞的選擇性主要在消化道上皮癌細(xì)胞最為突出，符合弱毒株的特性。
　　 2.NDV HBnu株F基因組序列由1707個(gè)堿基組成，屬于基因Ⅱ型弱毒力病毒株。
　　 3.NDV株與其他GenBank上公布的24株毒株比較，核苷酸同源性在73％-95.5％之間，氨基酸同源性在50.