鴨源雞桿菌中國分離株F17樣菌毛基因的鑒定及其敲除株的構(gòu)建.pdf

1、鴨源雞桿菌(Gallibacterium anatis，G.anatis)是巴氏桿菌科雞桿菌屬的革蘭氏陰性菌，主要感染雞、火雞、鴨、鵝等禽類。目前越來越多的研究證明，G.anatis作為一種條件性致病菌，不僅是構(gòu)成雞上呼吸道和下生殖道正常菌群的一部分，也可引起蛋雞輸卵管炎、腹膜炎等疾病，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量下降、死亡率增加等。目前已經(jīng)確定了G.anatis的數(shù)種毒力因子，但其致病機(jī)制仍未被闡明。
　　黏附是微生物定殖并侵襲黏膜組織的關(guān)鍵過程

2、。G.anatis作為一種黏膜微生物，已經(jīng)被證實(shí)具有黏附塑料制品、形成生物被膜及產(chǎn)生一種糖蛋白樣血凝素等黏附相關(guān)功能，但在G.anatis定殖感染自然宿主的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的具體因素還不清楚。在巴氏桿菌科的其他成員中，已經(jīng)報(bào)道了包括菌毛在內(nèi)的多種黏附素的存在，其中菌毛作為一種毛發(fā)樣、細(xì)長的菌體表面附屬結(jié)構(gòu)，是多種細(xì)菌的重要毒力因子。
　　鑒于以上背景，本研究對鴨源雞桿菌中國分離株中F17樣菌毛主要類型Flf的分布與表達(dá)情況進(jìn)行了

3、探究，并分析菌毛主要亞單位蛋白FlfA的免疫原性和反應(yīng)原性。同時(shí)，通過鴨源雞桿菌對雞輸卵管原代上皮細(xì)胞的黏附和侵襲特性研究，篩選出致病力相對強(qiáng)的臨床分離株作為敲除株構(gòu)建的野生菌株。最后，嘗試對F17樣菌毛的flfA基因進(jìn)行缺失，以期為分析該菌毛在G.anatis感染和致病過程中發(fā)揮的作用提供良好的基礎(chǔ)材料。本論文詳細(xì)研究內(nèi)容如下：
　　1、鴨源雞桿菌flfA基因的鑒定分析及原核表達(dá)
　　參照GenBank中G.anatis

4、UMN179的全基因組序列，針對flfA基因設(shè)計(jì)1對特異性引物，擴(kuò)增并克隆flfA全基因片段。結(jié)果顯示，flfA基因在鴨源雞桿菌中國分離株中廣泛存在?；蛐蛄蟹治霭l(fā)現(xiàn)，18株G.anatis中國分離株的flfA基因序列同源性為71.1％-100%,與國外參考株的序列同源性為70.2%-99.8%。其推倒的氨基酸序列分析顯示，F(xiàn)lfA蛋白具有6-8個(gè)優(yōu)勢的抗原表位，并多位于保守序列區(qū)。同時(shí)，根據(jù)對小鼠致病力強(qiáng)的分離株Yu-PDS-RZ-1

5、-SLG的flfA全基因序列設(shè)計(jì)1對特異性引物，并以其基因組DNA為模板擴(kuò)增flfA表達(dá)片段。將該片段成功克隆到原核表達(dá)載體pET-28a，并轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，成功表達(dá)FlfA。將上述純化的重組蛋白免疫家兔，得到兔源FlfA多克隆血清。Western blotting結(jié)果表明,FlfA蛋白不僅具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，而且在不同菌株均能表達(dá)，暗示不同毒株的FlfA同系物之間可能存在交叉免疫保護(hù)的能力。該試驗(yàn)確定了

6、Flf菌毛類型在鴨源雞桿菌中國分離株中存在的廣泛性，揭示抗原性良好的FlfA蛋白具有作為疫苗候選蛋白的潛能，同時(shí)該研究為后續(xù)flfA基因缺失突變株的構(gòu)建提供可靠的免疫學(xué)檢測方法。
　　2、鴨源雞桿菌對雞輸卵管原代上皮細(xì)胞黏附和侵襲能力的測定
　　本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色法檢測鴨源雞桿菌Yu-PDS-Ru-1-SLG株的黏附和侵襲特性，同時(shí)利用菌落計(jì)數(shù)法測定不同鴨源雞桿菌分離株對雞原代輸卵管上皮細(xì)胞黏附能力。免疫組織化學(xué)檢測

7、結(jié)果顯示：鴨源雞桿菌Yu-PDS-Ru-1-SLG感染后0.5、1、1.5、2、3、4h時(shí)均未觀察到有細(xì)菌侵襲細(xì)胞的現(xiàn)象，但能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生明顯的病變，并逐漸破碎脫落；鴨源雞桿菌Yu-PDS-Ru-1-SLG株對雞輸卵管原代上皮細(xì)胞具有一定的黏附能力，并且在一定時(shí)間內(nèi)隨著時(shí)間的延長黏附于單個(gè)細(xì)胞的菌量呈現(xiàn)遞增趨勢。不同菌株黏附試驗(yàn)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，不同鴨源雞桿菌分離株對雞輸卵管原代上皮細(xì)胞的黏附能力差異很大。通過免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)一步證明Y

8、u-PDS-Ru-1-SLG株不具有侵襲雞輸卵管原代上皮細(xì)胞的能力，并且不同鴨源雞桿菌菌株對雞輸卵管原代上皮細(xì)胞黏附能力的差異可能預(yù)示其致病力的差異。
　　3、鴨源雞桿菌flfA基因缺失突變株的篩選
　　本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的G.anatis UMN179的全基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增并克隆flfA基因的上、下游同源臂，分別以質(zhì)粒pBC-SK和自殺性質(zhì)粒pRE112為骨架，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pBC-flfA-Gm

9、r和pREΔflfA。將上述兩種重組質(zhì)粒分別通過自然轉(zhuǎn)化法和接合轉(zhuǎn)移法進(jìn)行缺失突變株的篩選。用于同源重組的打靶片段和自殺性打靶質(zhì)粒均能成功轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移入相應(yīng)G.anatis菌株中。在自然轉(zhuǎn)化法中，篩選了大約3000個(gè)CFU仍沒有得到flfA基因缺失突變株。在接合轉(zhuǎn)移法中，獲得flfA基因的單交換菌株，但篩選了大約10000個(gè)CFU仍沒有得到flfA基因缺失突變株。通過自然轉(zhuǎn)化法構(gòu)建鴨源雞桿菌突變株的過程很簡便，但對菌株的要求很高，很難篩選